BIOCATALYTIC SYNTHESIS OF CHIRAL PHARMACEUTICAL INTERMEDIATES

The Doctoral Thesis has been structured into two parts preceded by a general introduction that covers basic concepts on biocatalysis with special focus on application of whole cells of unconventional yeasts and a new ketoreducatese from Pichia glucozyma. All these thematic issues give a background to the following two parts, where the experimental results have been deeply discussed. Part 1 The biocatalytic potential of whole cells of P. glucozyma have been studied through biotransformations using substrates of different chemical nature having interesting pharmaceutical and synthetic aspects. After optimization of the reaction conditions through the transformation of acetophenone in (S)-1-phenylethanol, the attention was focused on the reduction of different aromatic ketones. All the reactions occurred with high yields and high enantiomeric excess for the corresponding (S)-alcohols. Part 2 Bioreduction catalysed by NADPH-dependent benzil-reductase (KRED1-Pglu) from Pichia glucozyma provides an attractive approach for selectively reducing a broad range of aromatic ketones. After protein identification, characterization and over-expression in E. coli, we have established a procedure for the purification and storage of KRED1-Pglu. After optimization of the reaction parameters, a thorough study of the substrate range of KRED1-Pglu was conducted. KRED1-Pglu prefers space demanding substrates which are often converted with high stereoselectivity. The observed activities and enantioselectivities were explained with a molecular modelling study for understanding the structural determinants involved in the stereorecognition experimentally observed and unpredictable on the basis of steric properties of the substrate. In conclusion, different efficient and sustainable methods for the stereoselective reduction of prochiral ketones using both whole cells of unconventional yeasts such as P. glucozyma CBS 5766 and the isolated enzyme KRED1-Pglu have been proposed in this PhD work.

Questa Tesi di Dottorato è stata strutturata in due parti differenti precedute da un’introduzione riguardante i principi fondamentali della biocatalisi con particolare attenzione sull’applicazione di cellule intere di lieviti non convenzionali e una nuova chetoreduttasi proveniente dal lievito Pichia glucozyma. Tutte queste tematiche rappresentano il “background” per poter meglio comprendere le parti sperimentali descritte nei successivi paragrafi. Parte 1 Il potenziale biocatalitico rappresentato da cellule intere di P. glucozyma è stato studiato usando substrati di differente natura chimica interessanti sia dal punto di vista farmaceutico che sintetico. Dopo l’ottimizzazione delle condizioni di reazione, effettuata sulla trasformazione dell’acetofenone in (S)-1-feniletanolo, l’attenzione è stata focalizzata sulla riduzione di differenti chetoni aromatici. Tutte le reazioni generalmente avvengono con elevate rese ed elevata selettività per il corrispondente (S)-alcol. Parte 2 Riduzioni catalizzate da una benzil-reduttasi (KRED1-Pglu) NADPH-dipendente proveniente da P. glucozyma, rappresentano un’ interessante strategia sintetica per la riduzione stereoselettiva di chetoni aromatici. Dopo identificazione, la caratterizzazione e l’over-espressione della proteina in E. coli, un metodo di purificazione e conservazione dell’enzima è stato messo a punto. Dopo ottimizzazione dei parametri di reazione, è stato effettuato un accurato studio riguardante i substrati accettati da KRED1-Pglu. Questa proteina preferisce substrati stericamente ingombrati, spesso convertiti con elevata stereoelettività. La differente enantioselettività sperimentalmente osservata, è stata spiegata mediante studi di docking molecolare. In conclusione, due differenti metodi efficienti ed eco-sostenibili per la riduzione stereoselettiva di diversi chetoni aromatici, utilizzando sia cellule intere di lieviti non convenzionali tra cui P. glucozyma CBS 5766 e l’enzima isolato KRED1-Pglu sono stati presentati in questo lavoro di tesi.