decision limits and capability of detection values, resulting in the ability to analyse the presence of analytes in extremely low concentrations (in

Negli ultimi anni si è osservato uno sviluppo delle tecniche e metodologie per la ricerca di residui di sostanze ad azione farmacologica in diverse matrici animali. Il miglioramento delle performances analitiche ha permesso di raggiungere bassi livelli di rivelazione, quindi la possibilità di analizzare la presenza di analiti a concentrazioni estremamente basse (nell’ordine di parti per trilione, ppt). L’abbassamento dei limiti di sensibilità ha permesso di evidenziare la presenza di sostanze che sotto determinati livelli di concentrazione possono essere considerate endogene. Una sfida per coloro che si occupano di analisi di residui è quindi la ricerca di sostanze che possiedono una duplice natura e, che sotto certe condizioni, possono essere ritenute endogene o possono essere considerate semi-naturali perché prodotte dall’animale in seguito a vari fattori come ingestione di alimenti contenenti precursori delle sostanze da indagare. Attualmente, è in corso un dibattito a livello europeo sull’origine di diversi analiti, tra i quali, in particolare, il boldenone, il prednisolone e il tiouracile. L’uso di tali sostanze in campo zootecnico per scopi illeciti di trattamento, al fine di ottenere un aumento del peso degli animali, è vietato dalla legislazione europea poiché i residui, presenti nei prodotti di origine animali, rappresentano un rischio per la salute del consumatore. Nonostante la ferrea regolamentazione europea per il divieto in allevamento dell’uso di sostanze a scopi auxinici, diversi casi di animali positivi a tali sostanze sono stati riportati ma, considerato l’elevato numero di positività tale da non poter collegare la presenza della sostanza a un abuso, è stata proposta l’ipotesi di origine endogena o semi-naturale. La presente tesi vuole andare ad indagare la natura endogena o semi-naturale di due note sostanze: il boldenone, steroide anabolizzante, nell’nell’urina di vitellone da carne; il prednisolone nell’urina e ghiandole surrenali del suini. entrambi steroidi che differiscono dai più noti testosterone e cortisolo per la presenza di un solo doppio legame nel primo anello della loro struttura. Il primo lavoro verte sullo sviluppo e validazione di un metodo analitico per la diretta determinazione di boldenone coniugato e libero e androstadienedione, a cui segue un lavoro realizzato in collaborazione con l’università di Torino con la partecipazione del gruppo del prof. Biolatti, per verificare la produzione endogena di β-boldenone attraverso la determinazione dei metaboliti di II fase, glucuronato e solfato, in urina di vitelloni sottoposti a particolari condizioni ambientali di stress. Lo studio condotto ha confermato la presenza endogena dei coniugati del boldenone in condizioni di assente o relativamente basso stress, mentre non è stata osservata alcuna positività al boldenone solfato e glucuronato nei campioni prelevati al macello, quando gli animali sono sottoposti ad elevati livelli di stress dovuto alle diverse procedure che anticipano la macellazione. Le ipotesi che cercano di spiegare la presenza semi-naturale di prednisolone in animali come i bovini, fanno riferimento ad una produzione endogena o una neo-formazione ex vivo nelle urine di animali contaminate dalle feci. Tuttavia, anche la possibile ingestione di mangime contenente prednisolone dovrebbe essere considerata. Considerate le scarse informazioni al riguardo, abbiamo voluto analizzare diversi mangimi complementari disponibili in commercio e conservati sia in azienda agricola che in condizioni controllate in laboratorio per verificare se l’eventuale presenza di steroide nel mangime fosse dovuta alle condizioni ambientali di conservazione I dati ottenuti confermano il ruolo determinante delle modalità di conservazione poiché la quasi totalità di campioni risultata positiva al prednisolone è stata campionata in azienda. Ad oggi, la presenza di prednisolone nelle urine come esito di produzione endogena o correlata a una condizione di stress, è stata dimostrata nel bovino, nel cavallo e nell’uomo, ma scarse informazioni si hanno relativamente al suino. Il quarto lavoro della presente tesi riguarda la determinazione della presenza di prednisolone in urine di suino prelevate in allevamento ed in urine e ghiandole surrenali campionate in macello e di stabilire se la presenza di prednisolone fosse correlata a condizioni di stress per l’animale o a un trattamento illecito. Un secondo obiettivo del lavoro svolto è stato quello di verificare un possibile trattamento illecito dovuto a presenza di corticosteroidi. La sperimentazione, finanziata dalla Regione Lombardia, ha previsto la valutazione della differenza nella frequenza di ritrovamento e nella concentrazione del corticosteroide nelle urine di animali in allevamento rispetto alle urine degli stessi animali al macello. Il lavoro ha confermato la presenza endogena di prednisolone nel suino, in quanto riscontrato nella maggioranza delle ghiandole surrenali. Inoltre, è stata osservata una relazione fra presenza di prednisolone e cortisolo in urina direttamente correlata alla intensità della stress. Infatti, la percentuale maggiore di positività al prednisolone nelle urine è stata verificata in sede di macello. Nello studio, il sospetto di un eventuale abuso prednisolone è stato avanzato solo per un animale a causa dell’elevata concentrazione dell’analita nel campione di urina. Un ulteriore problema dibattuto nei laboratori europei riguarda la determinazione di un livello di cut-off del tiouracile in urina e tiroidi per definirne l’origine naturale. Verificare la presenza di tireostatici nella tiroide dei bovini e confrontare i risultati ottenuti mediante l’analisi delle urine, potrebbe essere un buon metodo per rispondere a questa esigenza. Pertanto, l’ultima parte della tesi riguarda lo sviluppo di una metodica per la determinazione di cinque tireostatici, tiouracile, propiltiouracile, metiltiouracile, feniltiouracile e tapazolo. Diversi metodi sono stati pubblicati riguardo le modalità di estrazione dei tireostatici, ma è pratica comune eseguire una derivatizzazione degli analiti prima della loro estrazione, comportando una possibile perdita degli analiti stessi. Il metodo che è stato sviluppato e inserito nella presente tesi, permette l’estrazione diretta di tireostatici senza condurre una derivatizzazione e permette un confronto fra i risultati ottenuti con i due metodi. Quindi, il lavoro condotto potrebbe essere un ottimo strumento non solo in un contesto di monitoraggio, ma anche per le ricerche incentrate sull'origine naturale di tireostatici.

RESIDUES FROM ANABOLIC AGENTS IN FOOD-PRODUCING ANIMALS: A FOCUSED EVALUATION OF ¿SEMI-NATURAL¿ OCCURRENCE OF HORMONAL ACTIVE COMPOUNDS / E. Pasquale ; tutor: L.M. Chiesa; coordinatore: G. Gandini. - : . DIPARTIMENTO DI SCIENZE VETERINARIE E SANITA' PUBBLICA, 2015 Dec 10. ((28. ciclo, Anno Accademico 2015. [10.13130/e-pasquale_phd2015-12-10].

RESIDUES FROM ANABOLIC AGENTS IN FOOD-PRODUCING ANIMALS: A FOCUSED EVALUATION OF ¿SEMI-NATURAL¿ OCCURRENCE OF HORMONAL ACTIVE COMPOUNDS

E. Pasquale
2015-12-10

Abstract

Negli ultimi anni si è osservato uno sviluppo delle tecniche e metodologie per la ricerca di residui di sostanze ad azione farmacologica in diverse matrici animali. Il miglioramento delle performances analitiche ha permesso di raggiungere bassi livelli di rivelazione, quindi la possibilità di analizzare la presenza di analiti a concentrazioni estremamente basse (nell’ordine di parti per trilione, ppt). L’abbassamento dei limiti di sensibilità ha permesso di evidenziare la presenza di sostanze che sotto determinati livelli di concentrazione possono essere considerate endogene. Una sfida per coloro che si occupano di analisi di residui è quindi la ricerca di sostanze che possiedono una duplice natura e, che sotto certe condizioni, possono essere ritenute endogene o possono essere considerate semi-naturali perché prodotte dall’animale in seguito a vari fattori come ingestione di alimenti contenenti precursori delle sostanze da indagare. Attualmente, è in corso un dibattito a livello europeo sull’origine di diversi analiti, tra i quali, in particolare, il boldenone, il prednisolone e il tiouracile. L’uso di tali sostanze in campo zootecnico per scopi illeciti di trattamento, al fine di ottenere un aumento del peso degli animali, è vietato dalla legislazione europea poiché i residui, presenti nei prodotti di origine animali, rappresentano un rischio per la salute del consumatore. Nonostante la ferrea regolamentazione europea per il divieto in allevamento dell’uso di sostanze a scopi auxinici, diversi casi di animali positivi a tali sostanze sono stati riportati ma, considerato l’elevato numero di positività tale da non poter collegare la presenza della sostanza a un abuso, è stata proposta l’ipotesi di origine endogena o semi-naturale. La presente tesi vuole andare ad indagare la natura endogena o semi-naturale di due note sostanze: il boldenone, steroide anabolizzante, nell’nell’urina di vitellone da carne; il prednisolone nell’urina e ghiandole surrenali del suini. entrambi steroidi che differiscono dai più noti testosterone e cortisolo per la presenza di un solo doppio legame nel primo anello della loro struttura. Il primo lavoro verte sullo sviluppo e validazione di un metodo analitico per la diretta determinazione di boldenone coniugato e libero e androstadienedione, a cui segue un lavoro realizzato in collaborazione con l’università di Torino con la partecipazione del gruppo del prof. Biolatti, per verificare la produzione endogena di β-boldenone attraverso la determinazione dei metaboliti di II fase, glucuronato e solfato, in urina di vitelloni sottoposti a particolari condizioni ambientali di stress. Lo studio condotto ha confermato la presenza endogena dei coniugati del boldenone in condizioni di assente o relativamente basso stress, mentre non è stata osservata alcuna positività al boldenone solfato e glucuronato nei campioni prelevati al macello, quando gli animali sono sottoposti ad elevati livelli di stress dovuto alle diverse procedure che anticipano la macellazione. Le ipotesi che cercano di spiegare la presenza semi-naturale di prednisolone in animali come i bovini, fanno riferimento ad una produzione endogena o una neo-formazione ex vivo nelle urine di animali contaminate dalle feci. Tuttavia, anche la possibile ingestione di mangime contenente prednisolone dovrebbe essere considerata. Considerate le scarse informazioni al riguardo, abbiamo voluto analizzare diversi mangimi complementari disponibili in commercio e conservati sia in azienda agricola che in condizioni controllate in laboratorio per verificare se l’eventuale presenza di steroide nel mangime fosse dovuta alle condizioni ambientali di conservazione I dati ottenuti confermano il ruolo determinante delle modalità di conservazione poiché la quasi totalità di campioni risultata positiva al prednisolone è stata campionata in azienda. Ad oggi, la presenza di prednisolone nelle urine come esito di produzione endogena o correlata a una condizione di stress, è stata dimostrata nel bovino, nel cavallo e nell’uomo, ma scarse informazioni si hanno relativamente al suino. Il quarto lavoro della presente tesi riguarda la determinazione della presenza di prednisolone in urine di suino prelevate in allevamento ed in urine e ghiandole surrenali campionate in macello e di stabilire se la presenza di prednisolone fosse correlata a condizioni di stress per l’animale o a un trattamento illecito. Un secondo obiettivo del lavoro svolto è stato quello di verificare un possibile trattamento illecito dovuto a presenza di corticosteroidi. La sperimentazione, finanziata dalla Regione Lombardia, ha previsto la valutazione della differenza nella frequenza di ritrovamento e nella concentrazione del corticosteroide nelle urine di animali in allevamento rispetto alle urine degli stessi animali al macello. Il lavoro ha confermato la presenza endogena di prednisolone nel suino, in quanto riscontrato nella maggioranza delle ghiandole surrenali. Inoltre, è stata osservata una relazione fra presenza di prednisolone e cortisolo in urina direttamente correlata alla intensità della stress. Infatti, la percentuale maggiore di positività al prednisolone nelle urine è stata verificata in sede di macello. Nello studio, il sospetto di un eventuale abuso prednisolone è stato avanzato solo per un animale a causa dell’elevata concentrazione dell’analita nel campione di urina. Un ulteriore problema dibattuto nei laboratori europei riguarda la determinazione di un livello di cut-off del tiouracile in urina e tiroidi per definirne l’origine naturale. Verificare la presenza di tireostatici nella tiroide dei bovini e confrontare i risultati ottenuti mediante l’analisi delle urine, potrebbe essere un buon metodo per rispondere a questa esigenza. Pertanto, l’ultima parte della tesi riguarda lo sviluppo di una metodica per la determinazione di cinque tireostatici, tiouracile, propiltiouracile, metiltiouracile, feniltiouracile e tapazolo. Diversi metodi sono stati pubblicati riguardo le modalità di estrazione dei tireostatici, ma è pratica comune eseguire una derivatizzazione degli analiti prima della loro estrazione, comportando una possibile perdita degli analiti stessi. Il metodo che è stato sviluppato e inserito nella presente tesi, permette l’estrazione diretta di tireostatici senza condurre una derivatizzazione e permette un confronto fra i risultati ottenuti con i due metodi. Quindi, il lavoro condotto potrebbe essere un ottimo strumento non solo in un contesto di monitoraggio, ma anche per le ricerche incentrate sull'origine naturale di tireostatici.
CHIESA, LUCA MARIA
GANDINI, GUSTAVO
decision limits and capability of detection values, resulting in the ability to analyse the presence of analytes in extremely low concentrations (in
boldenone; prednisolone; thyreostats; semi-natural compounds; HPLC-MS/MS; food safety
Settore VET/04 - Ispezione degli Alimenti di Origine Animale
RESIDUES FROM ANABOLIC AGENTS IN FOOD-PRODUCING ANIMALS: A FOCUSED EVALUATION OF ¿SEMI-NATURAL¿ OCCURRENCE OF HORMONAL ACTIVE COMPOUNDS / E. Pasquale ; tutor: L.M. Chiesa; coordinatore: G. Gandini. - : . DIPARTIMENTO DI SCIENZE VETERINARIE E SANITA' PUBBLICA, 2015 Dec 10. ((28. ciclo, Anno Accademico 2015. [10.13130/e-pasquale_phd2015-12-10].
Doctoral Thesis
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