Inserzione di canali ionici in matrici lipidiche (II). I canali di membrana giocano un ruolo fondamentale nei meccanismi biologici. La determinazione delle loro proprietà microscopiche è molto importante al fine di comprendere le loro reali proprietà e funzioni nelle membrane delle cellule viventi. Scopo di questa ricerca è stato lo studio delle condizioni ottimali per l'inserimento di porine mitocondriali in doppi strati lipidici di fosfatidilinositolo (PI) e di colesterolo ossidato (OC). Il doppio strato lipidico è stato formato sul foro di una parete che separa due compartimenti (riempiti con soluzioni di KCl) in una cella di Teflon e la variazione dei parametri elettrici è stata seguita mediante corrente alternata. Dai dati sperimentali si sono tratte le seguenti conclusioni: 1) le membrane di OC (lipide neutro) hanno valori di conduttanza e di capacità maggiori rispetto a quelli delle membrane di PI (lipide carico negativamente); 2) le membrane di OC non presentano grandi variazioni dei valori di conduttanza in tutto l'intervallo di concentrazioni di KCI preso in esame (0-1 M); discorso analogo vale per i valori di capacità; 3) le membrane di PI non mostrano variazioni significative dei due parametri, per concentrazioni di KCl comprese tra 0,3 M e 1,0 M (in questo intervallo di concentrazioni la conduttanza va da un minimo di 2,03±0,21 microS/cm2 ad un massimo di 2,40±0,35 microS/cm2; la capacità va da un minimo di 207,7±11,9 nF/cm2 ad un massimo di 255,9±8,0 nF/cm2); si nota invece una spiccata dipendenza della conduttanza e della capacità per concentrazioni di KCl inferiori; 4) i valori dell'angolo di fase oscillano tra un minimo di 0,526±0,042 rad ed un massimo di 0,669±0,025 rad per le membrane di PI, e tra un minimo di 0,577±0,029 rad ed un massimo di 0,666±0,031 rad per le membrane di OC; non si notano quindi differenze significative tra i due tipi di membrane; 5) le cinetiche di incorporazione delle molecole di porina nelle membrane di PI sono a forma di S, indipendentemente dalle condizioni sperimentali; la formazione dei canali è più veloce e raggiunge livelli di steady-state più elevati se la porina è aggiunta dopo la formazione della membrana; 6) la cinetica di incorporazione nelle membrane di OC assume forma a S quando la porina è aggiunta dopo che si è formata la membrana; se invece essa è già presente in soluzione, la cinetica ha un andamento di tipo esponenziale; 7) l'incorporazione dei canali di porina è più veloce e raggiunge valori di stato stazionario più elevati se avviene in una membrana di OC, rispetto ad una di PI nelle stesse condizioni; 8) a parità di potenziale imposto, le cinetiche di incorporazione della porina sono più rapide e raggiungono valori di stato stazionario più elevati aumentando la concentrazione proteica in soluzione: sia nelle membrane di PI sia in quelle di OC; 9) le membrane di OC incorporano più facilmente canali di porina rispetto alle membrane di PI; usando però concentrazioni di porina molto elevate (oltre 10 ng/ml) si assiste ad una specie di "auto-inattivazione" della porina stessa: la cinetica rallenta e il valore di stato stazionario diminuisce; 10) la d.d.p. influenza significativamente l'incorporazione della porina. I due tipi di lipidi utilizzati portano alla formazione di strutture membranarie con differenti comportamenti. Il PI determina la formazione di membrane molto stabili. Poiché invece il colesterolo naturale non è stabile, si ricorre al OC, miscela di diversi lipidi. I due lipidi presentano una diversa distribuzione delle cariche elettriche, fattore importante per le interazioni tra la porina e la membrana. L'incorporazione nelle membrane di PI, data la sua carica negativa, risulta più difficoltosa. È stato infatti appurato che la cinetica è sempre sigmoidale e tende a rallentare nelle seconde membrane (quelle formate con la proteina già presente in soluzione). Nelle prime membrane di OC la cinetica è indubbiamente più veloce rispetto a quella con membrane di PI e nelle seconde diventa esponenziale. Sembra quindi che le interazioni elettrostatiche giochino un ruolo fondamentale anche nelle differenze di comportamento riscontrate tra prime e seconde membrane. Indipendentemente dalle condizioni sperimentali adottate l'incorporazione dei canali di porina tende sempre ad uno stato stazionario, ovvero ad una situazione in cui il numero dei canali aperti e funzionanti è costante. In entrambi i tipi di membrane è stato osservato che aumentando la concentrazione di porina si ottiene un aumento delle velocità di incorporazione ed anche valori più elevati della conduttanza allo stato stazionario. Nelle membrane di PI l'incorporazione giunge a saturazione per valori di concentrazione proteica relativamente bassi (60-90 ng/ml), aumentando i quali si ottiene una cinetica più rapida ma valori di stato stazionario costanti. Nel caso di membrane di OC invece si giunge a valori di stato stazionario costanti per concentrazioni proteiche notevolmente inferiori (5-8 ng/ml); la cinetica di incorporazione è più rapida e quindi lo stato stazionario è raggiunto più velocemente. Il valore della conduttanza, e quindi il numero dei canali incorporati e aperti nella membrana lipidica, dipende da due fattori fondamentali: la concentrazione proteica e la composizione della membrana. La valutazione della dipendenza della conduttanza dal voltaggio, indipendentemente dalla sua origine, potrebbe dimostrarsi utile ai fini di realizzare dei semiconduttori organici, montati appositamente su idonei supporti solidi. La formulazione di questi sensori organici, che potrebbero reagire a variazioni di potenziale elettrico o ad alterazioni del mezzo in cui sono posti, potrebbe portare ad innovazioni nel campo dell'elettronica e dell'informatica o al loro utilizzo come biosensori. I risultati sperimentali mostrano la possibilità, variando opportunamente le condizioni sotto cui si realizza l'incorporazione proteica, di realizzare strutture organiche (lipidi + proteine) con caratteristiche elettriche predeterrninate. Il problema ancora da risolvere è quello relativo alla stabilità nel tempo in quanto è emerso che in seguito all'incorporazione delle molecole proteiche nel doppio strato lipidico, il doppio strato stesso risulta meno stabile e quindi più suscettibile di rottura.

Inserzione di canali ionici in matrici lipidiche (II) / G. Monticelli. - Milano : Università degli Studi di Milano, 1994 Dec.

Inserzione di canali ionici in matrici lipidiche (II)

G. Monticelli
Primo
1994

Abstract

Inserzione di canali ionici in matrici lipidiche (II). I canali di membrana giocano un ruolo fondamentale nei meccanismi biologici. La determinazione delle loro proprietà microscopiche è molto importante al fine di comprendere le loro reali proprietà e funzioni nelle membrane delle cellule viventi. Scopo di questa ricerca è stato lo studio delle condizioni ottimali per l'inserimento di porine mitocondriali in doppi strati lipidici di fosfatidilinositolo (PI) e di colesterolo ossidato (OC). Il doppio strato lipidico è stato formato sul foro di una parete che separa due compartimenti (riempiti con soluzioni di KCl) in una cella di Teflon e la variazione dei parametri elettrici è stata seguita mediante corrente alternata. Dai dati sperimentali si sono tratte le seguenti conclusioni: 1) le membrane di OC (lipide neutro) hanno valori di conduttanza e di capacità maggiori rispetto a quelli delle membrane di PI (lipide carico negativamente); 2) le membrane di OC non presentano grandi variazioni dei valori di conduttanza in tutto l'intervallo di concentrazioni di KCI preso in esame (0-1 M); discorso analogo vale per i valori di capacità; 3) le membrane di PI non mostrano variazioni significative dei due parametri, per concentrazioni di KCl comprese tra 0,3 M e 1,0 M (in questo intervallo di concentrazioni la conduttanza va da un minimo di 2,03±0,21 microS/cm2 ad un massimo di 2,40±0,35 microS/cm2; la capacità va da un minimo di 207,7±11,9 nF/cm2 ad un massimo di 255,9±8,0 nF/cm2); si nota invece una spiccata dipendenza della conduttanza e della capacità per concentrazioni di KCl inferiori; 4) i valori dell'angolo di fase oscillano tra un minimo di 0,526±0,042 rad ed un massimo di 0,669±0,025 rad per le membrane di PI, e tra un minimo di 0,577±0,029 rad ed un massimo di 0,666±0,031 rad per le membrane di OC; non si notano quindi differenze significative tra i due tipi di membrane; 5) le cinetiche di incorporazione delle molecole di porina nelle membrane di PI sono a forma di S, indipendentemente dalle condizioni sperimentali; la formazione dei canali è più veloce e raggiunge livelli di steady-state più elevati se la porina è aggiunta dopo la formazione della membrana; 6) la cinetica di incorporazione nelle membrane di OC assume forma a S quando la porina è aggiunta dopo che si è formata la membrana; se invece essa è già presente in soluzione, la cinetica ha un andamento di tipo esponenziale; 7) l'incorporazione dei canali di porina è più veloce e raggiunge valori di stato stazionario più elevati se avviene in una membrana di OC, rispetto ad una di PI nelle stesse condizioni; 8) a parità di potenziale imposto, le cinetiche di incorporazione della porina sono più rapide e raggiungono valori di stato stazionario più elevati aumentando la concentrazione proteica in soluzione: sia nelle membrane di PI sia in quelle di OC; 9) le membrane di OC incorporano più facilmente canali di porina rispetto alle membrane di PI; usando però concentrazioni di porina molto elevate (oltre 10 ng/ml) si assiste ad una specie di "auto-inattivazione" della porina stessa: la cinetica rallenta e il valore di stato stazionario diminuisce; 10) la d.d.p. influenza significativamente l'incorporazione della porina. I due tipi di lipidi utilizzati portano alla formazione di strutture membranarie con differenti comportamenti. Il PI determina la formazione di membrane molto stabili. Poiché invece il colesterolo naturale non è stabile, si ricorre al OC, miscela di diversi lipidi. I due lipidi presentano una diversa distribuzione delle cariche elettriche, fattore importante per le interazioni tra la porina e la membrana. L'incorporazione nelle membrane di PI, data la sua carica negativa, risulta più difficoltosa. È stato infatti appurato che la cinetica è sempre sigmoidale e tende a rallentare nelle seconde membrane (quelle formate con la proteina già presente in soluzione). Nelle prime membrane di OC la cinetica è indubbiamente più veloce rispetto a quella con membrane di PI e nelle seconde diventa esponenziale. Sembra quindi che le interazioni elettrostatiche giochino un ruolo fondamentale anche nelle differenze di comportamento riscontrate tra prime e seconde membrane. Indipendentemente dalle condizioni sperimentali adottate l'incorporazione dei canali di porina tende sempre ad uno stato stazionario, ovvero ad una situazione in cui il numero dei canali aperti e funzionanti è costante. In entrambi i tipi di membrane è stato osservato che aumentando la concentrazione di porina si ottiene un aumento delle velocità di incorporazione ed anche valori più elevati della conduttanza allo stato stazionario. Nelle membrane di PI l'incorporazione giunge a saturazione per valori di concentrazione proteica relativamente bassi (60-90 ng/ml), aumentando i quali si ottiene una cinetica più rapida ma valori di stato stazionario costanti. Nel caso di membrane di OC invece si giunge a valori di stato stazionario costanti per concentrazioni proteiche notevolmente inferiori (5-8 ng/ml); la cinetica di incorporazione è più rapida e quindi lo stato stazionario è raggiunto più velocemente. Il valore della conduttanza, e quindi il numero dei canali incorporati e aperti nella membrana lipidica, dipende da due fattori fondamentali: la concentrazione proteica e la composizione della membrana. La valutazione della dipendenza della conduttanza dal voltaggio, indipendentemente dalla sua origine, potrebbe dimostrarsi utile ai fini di realizzare dei semiconduttori organici, montati appositamente su idonei supporti solidi. La formulazione di questi sensori organici, che potrebbero reagire a variazioni di potenziale elettrico o ad alterazioni del mezzo in cui sono posti, potrebbe portare ad innovazioni nel campo dell'elettronica e dell'informatica o al loro utilizzo come biosensori. I risultati sperimentali mostrano la possibilità, variando opportunamente le condizioni sotto cui si realizza l'incorporazione proteica, di realizzare strutture organiche (lipidi + proteine) con caratteristiche elettriche predeterrninate. Il problema ancora da risolvere è quello relativo alla stabilità nel tempo in quanto è emerso che in seguito all'incorporazione delle molecole proteiche nel doppio strato lipidico, il doppio strato stesso risulta meno stabile e quindi più suscettibile di rottura.
dic-1994
doppio strato lipidico ; fosfatidilinositolo ; colesterolo ossidato ; porina mitocondriale ; incorporazione porina ; cinetica incorporazione ; canale funzionale ; conduttanza elettrica membrana ; capacità elettrica membrana ; potassio cloruro e incorporazione ; potenziale elettrico e incorporazione ; velocità incorporazione ; semiconduttore organico ; biosensore
Settore BIO/09 - Fisiologia
CNR - Consiglio Nazionale delle Ricerche
Working Paper
Inserzione di canali ionici in matrici lipidiche (II) / G. Monticelli. - Milano : Università degli Studi di Milano, 1994 Dec.
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Descrizione: Relazione scientifica relativa al periodo di attività 1993-1994 - Contributo n. 93.02037.14.115.7808, Comitato Nazionale Biotecnologie e Biologia Molecolare
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