ANTI-TUMORAL EFFECTS OF MIR-3189-3P IN GLIOBLASTOMA

SUMMARY Background: Glioblastoma is a deadly cancer characterized by rapid cell proliferation, high invasiveness, and resistance to radio- and chemotherapy. Patients with this aggressive tumor, which accounts for nearly 50% of all adult brain tumors, have a median survival of approximately 15 months. The standard treatment for glioblastoma involves invasive surgery and radiotherapy, which is often followed by chemotherapy with temolozomide. As the development of novel therapeutic treatments for glioblastoma are desperately needed, it is essential to understand the molecular mechanisms supporting growth and survival of this highly malignant and practically incurable brain tumor. Growth Differentiation Factor 15, GDF15, also known as Nonsteroidal Anti-inflammatory drug-activated Gene -1 (NAG-1) or Macrophage Inhibitory Cytokine-1 (MIC-1), is a member of the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily. The GDF15 gene is encoded by two exons to generate a precursor protein containing a 167 amino acid pro-peptide sequence and a 112 amino acid mature domain. Upon dimerization, this precursor protein is cleaved resulting in the release of the 112 amino acid mature GDF15 peptide, which is secreted into the extracellular matrix as a biologically active dimer. GDF15 can be induced by anti-inflammatory drugs, cytotoxic agents, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonist, and anticancer drugs. Increased GDF15 mRNA expression has been reported in patients during malignant progression to glioblastoma, and others have reported that expression levels of GDF15 are upregulated in glioblastoma cells in response to cytotoxic stimuli during chemotherapy treatment. We have previously reported increased expression of GDF15 in the LN-229 glioblastoma cell line following the treatment with fenofibrate, an agonist of PPARα. In this study, we have analyzed the genomic sequence of GDF15 and found it contains a microRNA, miR-3189, encoded within its single intron at a position proximal to exon 1. The precursor sequence encoded by miR-3189 contains two mature microRNA sequences within the stem-loop: miR-3189-3p and miR-3189-5p, of 21 and 25 nucleotides in length, respectively. The biological function of this microRNA has never been described before. Because of the role of microRNAs in gene regulation, we wanted to define the effects of these co-expressed microRNAs, miR-3189-3p and miR-3189-5p, in the biological function of GDF15. Methods: The expression of GDF15 by Real-time PCR, Western Blots and Elisa assays and miR-3189-3p by Real-time PCR was evaluated in LN-229 cells stimulated with Fenofibrate. Transfections were performed in order to validate the targeting of miR-3189-3p on the 3’UTR of two of its major predicted targets SF3B2 and p63RhoGEF. The functional role of miR-3189-3p was assessed through Real-time PCR, Western Blot, cell-growth and migration assays, and through both the subcutaneous and the intracranial injection in nude mice. Results: We found that treatment of glioblastoma cells with fenofibrate resulted in a striking increase in GDF15 mRNA and protein levels, which was accompanied by high expression of miR-3189-3p, and preceded fenofibrate-induced apoptosis. In this experimental condition, miR-3189-5p was not detected. Ectopic expression of miR-3189-3p inhibited LN-229 cell growth and migration through downregulation of the splicing factor SF3B2 and the guanine nucleotide exchange factor p63RhoGEF, respectively. In comparison to the normal brain tissue, we also found that glioblastoma clinical samples have increased levels of GDF15 and decreased levels of miR-3189-3p, and that these changes correlated with increased expression of SF3B2 and a trend of increased levels for p63RhoGEF. Finally, both the subcutaneous and the intracranial growth of glioblastoma cells expressing miR-3189-3p were significantly reduced when compared to control cells, thus further validating the role of this microRNA as a tumor suppressor. Conclusions: Our studies have demonstrated that miR-3189-3p has a tumor-suppressive role by controlling the growth and the migration of glioblastoma cells by targeting the SF3B2 and p63RhoGEF mRNAs.

Introduzione: Il glioblastoma e’ un tumore maligno del cervello, della categoria dei gliomi, caratterizzato da rapida crescita cellulare, elevata invasivita’, aggressivita’ e resistenza alla radio e chemioterapia. I soggetti colpiti da questa forma tumorale, che costituisce circa il 50% delle neoplasie maligne cerebrali negli adulti, hanno in media un’aspettativa di vita di quindici mesi. Il trattamento di base prevede l’asportazione della massa tumorale in combinazione alla radioterapia, eventualmente seguite da chemioterapia con temozolomide. Data l’estrema necessita’ di sviluppare nuove strategie terapeutiche per questo tumore fino ad ora praticamente incurabile, l’individuazione dei meccanismi molecolari che sono alla base della proliferazione e della sopravvivenza del glioblastoma e’ di fondamentale importanza. Growth Differentiation Factor 15 (GDF15), conosciuto anche con il nome di Nonsteroidal Anti-Inflammatory drug-activated Gene-1 (NAG-1) o Macrophage Inhibitory Cytokine-1 (MIC-1) e’ una proteina della famiglia del transforming growth factor-β (TGF-β). Il gene che codifica per GDF15 e’ costituito da due esoni che generano un precursore composto da un pro-peptide di 167 amminoacidi e da un dominio corrispondente al peptide maturo di 112 amminoacidi. In seguito alla dimerizzazione, avviene il clivaggio del precursore con il successivo rilascio del peptide maturo di 112 amminoacidi nella matrice extracellulare, dove agisce come dimero biologicamente attivo. L’espressione di GDF15 nei tessuti e’ notevolmente indotta in risposta a stimolazione con differenti farmaci anti-infiammatori, agenti citotossici, agonisti dei recettori della famiglia dei peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) e farmaci antitumorali. Il ruolo di GDF15 nella tumorigenesi non e’ stato ancora del tutto chiarito. Evidenze sperimentali dimostrano che elevati livelli di trascritto sono presenti in pazienti durante la progressione dello stadio tumorale da astrocitoma a glioblastoma, ma altri studi hanno dimostrato come l’espressione di GDF15 sia indotta in risposta a trattamenti chemioterapici. Metodi: L’espressione di GDF15 mediante saggi di Real-time PCR, Western Blot ed Elisa e del miR-3189-3p mediante Real-time PCR e’ stata valutata nella linea cellulare di glioblastoma LN-229 in seguito a stimolazione con Fenofibrato. Saggi di transfezione in vitro sono stati effettuati allo scopo di validare il targeting del miR-3189-3p sulla regione 3’UTR dei due geni SF3B2 e p63RhoGEF. Analisi di Real-time PCR, Western Blot, di proliferazione e migrazione cellulare in vitro e l’iniezione subcutanea ed intracranica in topi nudi di cellule di glioblastoma precedentemente transfettate con il miR-3189-3p, sono state eseguite al fine di studiare il ruolo funzionale del miR-3189-3p. Risultati: Risultati precedentemente ottenuti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che la stimolazione della linea cellulare LN-229 con il fenofibrato, un agonista di PPARα, determina un aumento di espressione di GDF15. Nel presente studio, dall’analisi della sequenza genica di GDF15 e’ risultata di particolare interesse la presenza di un microRNA, miR-3189, all’interno del suo unico introne, in posizione prossimale all’esone 1. Il pre-mir-3189 contiene due sequenze di microRNA mature all’interno dell sua struttura a forcina: miR-3189-3p e miR-3189-5p, rispettivamente di 21 e 25 nucleotidi. Ad oggi non ci sono studi che abbiano riportato la funzione biologica di tale microRNA, pertanto dato il ruolo che ricoprono i microRNA nella regolazione genica, scopo principale di questo lavoro e’ stato innanzitutto quello di definire gli effetti dei due microRNA, miR-3189-3p e -5p, nella funzione biologica di GDF15 nei glioblastomi. Abbiamo scoperto che l’induzione del trascritto e della proteina in seguito a stimolazione con fenofibrato e’ accompagnata da una elevata espressione del miR-3189-3p e precede gli eventi di apoptosi innescati dal fenofibrato. Nelle medesime condizioni sperimentali non e’ stata osservata invece induzione del miR-3189-5p. Inoltre, mediante saggi di transfezione, abbiamo dimostrato che l’espressione ectopica del miR-3189-3p determina una inibizione della proliferazione e della migrazione cellulare mediante il silenziamento di due dei suoi mRNA bersaglio predetti, rispettivamente il fattore di splicing SF3B2 e il fattore di scambio del nucleotide guanina p63RhoGEF. Dall’analisi di espressione genica su campioni di glioblastoma e di tessuti normali abbiamo trovato che ad un aumento dei livelli di espressione di GDF15 nei glioblastomi corrisponde un decremento dei livelli di miR-3189-3p e, in aggiunta, queste differenze di espressione correlano con un incremento nei livelli di SF3B2 e una tendenza all’aumento in p63RhoGEF. Infine, esperimenti di iniezione subcutanea e intracranica di cellule di glioblastoma precedentemente transfettate con il miR-3189-3p, hanno mostrato una inibizione della crescita tumorale rispetto a cellule di controllo. Conclusioni: Tutte queste evidenze sperimentali supportano e validano il ruolo di miR-3189-3p come oncosoppressore nei glioblastomi mediante il controllo della crescita e della migrazione cellulare attraverso il silenziamento rispettivamente di SF3B2 e p63RhoGEF.