Hypertension is a major risk factor for cardiovascular diseases. About 90% of cases are classified as essential hypertension, which means high blood pressure with no obvious underlying medical cause unless genetic factors. In these individuals hypertension is due to an increase of vascular resistance. The integrity and elasticity of vessels and the modulation of blood pressure are determined by smooth muscle cells and endothelial cells lining the vascular walls and by their relationship with extracellular matrix. Emilin1, an extracellular matrix glycoprotein, regulates blood pressure by inhibiting transforming growth factor TGF-β1 processing. When Emilin-1 is not expressed in vascular smooth muscle cells, Emilin-1 knockout mice are characterized by an increase of TGF-β1 signaling and arteriolar myogenic response. To understand molecular bases of Emilin-1 deficiency in hypertension, we examined the proteomic profiles of aorta and mesenteric arteries in two animal models: constitutive Emilin-1 knockout mouse (KO) and Tamoxifen-inducible vascular smooth muscle cells specific knockout mouse (flox-flox). Wild-type mice and mice Tamoxifen-treated, respectively, were used as controls. Qualitative and quantitative proteomic differences were obtained combining two proteomics techniques: 2D-DIGE (Two Dimensional Differential In Gel Electrophoresis) and ICPL (Isotope-Coded Protein Labeling). To study the transcriptional regulation of the identified differentially expressed proteins, a transcription factor binding sites enrichment analysis was performed. Results indicate that in Emilin-1 KO model there is a general down-regulation of cellular proteins associated with metabolic dysregulation, loss of cytoskeletal proteins and reduction of vascular stiffness. In these mice Emilin-1 gene is expressed neither in smooth muscle nor in endothelial cells and blood vessels are constitutively smaller than controls. These results indicate that the KO model reflects the adaptation of smooth muscle to a congenital hypertension. Emilin-1 flox-flox model shows an up-regulation of some cellular proteins related to energy production, contractile activity and transcription of cytoskeletal and extracellular matrix proteins. In these mice, the conditional silencing of Emilin-1 gene is restricted to smooth muscle cells of blood vessels. The observed molecular alterations demonstrate, in this model, a direct association between hypertension and Emilin-1 deficiency. The transcription factor binding sites enrichment analysis shows that in both models, changes in chromatin structure induce genes expression of contractile markers of vascular smooth muscle cells. These cells may shift their phenotype in response to changes in blood pressure and TGF-β levels. Further progresses will be possible analyzing the pathophysiological mechanisms associated to Emilin-1 deficiency by considering proteomic and transcription factors binding sites enrichment analysis. However, to become relevant for human health, a validation in human subject is mandatory. In this way, these results can promote the identification of new targets for the prevention and/or treatment of hypertension.

L’ipertensione arteriosa è uno dei principali fattori di rischio per le patologie cardiovascolari. Più del 90% dei soggetti ipertesi è affetto da ipertensione essenziale, cioè ad eziologia non definita a parte la possibile predisposizione genetica, in cui l’aumento dei valori pressori sembra essere associato ad un aumento della resistenza arteriolare. L’integrità e l’elasticità di questi vasi come anche la modulazione della pressione arteriosa sono determinate dalle cellule muscolari lisce ed endoteliali che ne rivestono la parete e dalle loro connessioni con la matrice extracellulare. In quest’ultima è stata individuata una glicoproteina secreta, l’Emilina-1, che regola la pressione arteriosa inibendo il processamento del fattore di crescita TGF-β. In seguito alla mancanza di Emilina-1 nelle cellule muscolari lisce dei vasi, topi knockout presentano elevati livelli di TGF-β e un aumento del tono miogeno. Con l’obiettivo di comprendere le alterazioni molecolari che portano ad ipertensione arteriosa in seguito alla carenza di Emilina-1 sono stati analizzati i profili proteomici dell’aorta e delle arterie mesenteriche di due modelli animali: i topi Emilina-1 knockout (KO) e i topi Emilina-1 condizionali indotti da Tamoxifen (flox-flox), utilizzando come controlli rispettivamente topi sani e topi trattati con Tamoxifen. Le differenze qualitative e quantitative del proteoma sono state ottenute mediante la combinazione di due tecniche: la 2D-DIGE (Two Dimensional Differential In Gel Electrophoresis) e l’ICPL (Isotope-Coded Protein Labeling). Inoltre per studiare la regolazione delle proteine differenzialmente espresse identificate, sui promotori dei relativi geni è stata effettuata un’analisi di arricchimento in silico dei siti di legame dei fattori di trascrizione. I risultati ottenuti nel modello Emilina-1 KO mostrano una down-regolazione di gran parte delle proteine cellulari associata ad una disregolazione metabolica, alla perdita delle proteine citoscheletriche e all’attivazione di meccanismi per contrastare la rigidità vasale. In questi topi la proteina Emilina-1 non si esprime né nelle cellule endoteliali, né nelle cellule della muscolatura liscia dei vasi e questi ultimi risultano costitutivamente più piccoli rispetto ai controlli. Questi risultati riflettono la presenza di una muscolatura liscia adattata ad una condizione di ipertensione congenita. Il modello Emilina-1 flox-flox invece è caratterizzato da una up-regolazione di alcune proteine cellulari coinvolte nella produzione di energia, nell’attività contrattile e nella trascrizione genica di proteine del citoscheletro e della matrice extracellulare. Le variazioni riscontrate in questi topi, in cui l’espressione di Emilina-1 viene silenziata solo nelle cellule della muscolatura liscia dei vasi dopo la nascita, dimostrano che in questo modello è presente una correlazione tra l’instaurazione di uno stato ipertensivo e la carenza di Emilina-1. L’analisi dei siti di legame dei fattori di trascrizione ha invece messo in evidenza che in entrambi i modelli si verificano modificazioni della struttura della cromatina che portano alla trascrizione di geni specifici del fenotipo contrattile delle cellule muscolari lisce dei vasi. Queste cellule presentano infatti la capacità di modificare il proprio fenotipo in seguito a cambiamenti della pressione arteriosa e ad aumenti dei livelli di TGF-β. Ulteriori avanzamenti saranno possibili approfondendo i meccanismi patofisiologici associati alla carenza di Emilina-1, considerando i risultati ottenuti dall’analisi proteomica e di arricchimento dei siti di legame dei fattori di trascrizione. Tuttavia, perché questi siano rilevanti per la salute umana, sono necessarie delle validazioni su soggetti ipertesi. In questo modo, sarà possibile identificare nuovi bersagli per la prevenzione e/o la terapia dell’ipertensione arteriosa.

LE ALTERAZIONI DELLA MATRICE EXTRACELLULARE NELLA PATOGENESI DELL'IPERTENSIONE: EFFETTI DELLA CARENZA DI EMILINA-1 A LIVELLO DELL'AORTA E DELLE ARTERIE MESENTERICHE DI TOPO / L. Barbalini ; tutor: C. Gelfi ; coordinatore: M. Clerici. - : . DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE PER LA SALUTE, 2015 Jan 20. ((27. ciclo, Anno Accademico 2014. [10.13130/barbalini-laura_phd2015-01-20].

LE ALTERAZIONI DELLA MATRICE EXTRACELLULARE NELLA PATOGENESI DELL'IPERTENSIONE: EFFETTI DELLA CARENZA DI EMILINA-1 A LIVELLO DELL'AORTA E DELLE ARTERIE MESENTERICHE DI TOPO

L. Barbalini
2015

Abstract

L’ipertensione arteriosa è uno dei principali fattori di rischio per le patologie cardiovascolari. Più del 90% dei soggetti ipertesi è affetto da ipertensione essenziale, cioè ad eziologia non definita a parte la possibile predisposizione genetica, in cui l’aumento dei valori pressori sembra essere associato ad un aumento della resistenza arteriolare. L’integrità e l’elasticità di questi vasi come anche la modulazione della pressione arteriosa sono determinate dalle cellule muscolari lisce ed endoteliali che ne rivestono la parete e dalle loro connessioni con la matrice extracellulare. In quest’ultima è stata individuata una glicoproteina secreta, l’Emilina-1, che regola la pressione arteriosa inibendo il processamento del fattore di crescita TGF-β. In seguito alla mancanza di Emilina-1 nelle cellule muscolari lisce dei vasi, topi knockout presentano elevati livelli di TGF-β e un aumento del tono miogeno. Con l’obiettivo di comprendere le alterazioni molecolari che portano ad ipertensione arteriosa in seguito alla carenza di Emilina-1 sono stati analizzati i profili proteomici dell’aorta e delle arterie mesenteriche di due modelli animali: i topi Emilina-1 knockout (KO) e i topi Emilina-1 condizionali indotti da Tamoxifen (flox-flox), utilizzando come controlli rispettivamente topi sani e topi trattati con Tamoxifen. Le differenze qualitative e quantitative del proteoma sono state ottenute mediante la combinazione di due tecniche: la 2D-DIGE (Two Dimensional Differential In Gel Electrophoresis) e l’ICPL (Isotope-Coded Protein Labeling). Inoltre per studiare la regolazione delle proteine differenzialmente espresse identificate, sui promotori dei relativi geni è stata effettuata un’analisi di arricchimento in silico dei siti di legame dei fattori di trascrizione. I risultati ottenuti nel modello Emilina-1 KO mostrano una down-regolazione di gran parte delle proteine cellulari associata ad una disregolazione metabolica, alla perdita delle proteine citoscheletriche e all’attivazione di meccanismi per contrastare la rigidità vasale. In questi topi la proteina Emilina-1 non si esprime né nelle cellule endoteliali, né nelle cellule della muscolatura liscia dei vasi e questi ultimi risultano costitutivamente più piccoli rispetto ai controlli. Questi risultati riflettono la presenza di una muscolatura liscia adattata ad una condizione di ipertensione congenita. Il modello Emilina-1 flox-flox invece è caratterizzato da una up-regolazione di alcune proteine cellulari coinvolte nella produzione di energia, nell’attività contrattile e nella trascrizione genica di proteine del citoscheletro e della matrice extracellulare. Le variazioni riscontrate in questi topi, in cui l’espressione di Emilina-1 viene silenziata solo nelle cellule della muscolatura liscia dei vasi dopo la nascita, dimostrano che in questo modello è presente una correlazione tra l’instaurazione di uno stato ipertensivo e la carenza di Emilina-1. L’analisi dei siti di legame dei fattori di trascrizione ha invece messo in evidenza che in entrambi i modelli si verificano modificazioni della struttura della cromatina che portano alla trascrizione di geni specifici del fenotipo contrattile delle cellule muscolari lisce dei vasi. Queste cellule presentano infatti la capacità di modificare il proprio fenotipo in seguito a cambiamenti della pressione arteriosa e ad aumenti dei livelli di TGF-β. Ulteriori avanzamenti saranno possibili approfondendo i meccanismi patofisiologici associati alla carenza di Emilina-1, considerando i risultati ottenuti dall’analisi proteomica e di arricchimento dei siti di legame dei fattori di trascrizione. Tuttavia, perché questi siano rilevanti per la salute umana, sono necessarie delle validazioni su soggetti ipertesi. In questo modo, sarà possibile identificare nuovi bersagli per la prevenzione e/o la terapia dell’ipertensione arteriosa.
GELFI, CECILIA
CLERICI, MARIO SALVATORE
Hypertension is a major risk factor for cardiovascular diseases. About 90% of cases are classified as essential hypertension, which means high blood pressure with no obvious underlying medical cause unless genetic factors. In these individuals hypertension is due to an increase of vascular resistance. The integrity and elasticity of vessels and the modulation of blood pressure are determined by smooth muscle cells and endothelial cells lining the vascular walls and by their relationship with extracellular matrix. Emilin1, an extracellular matrix glycoprotein, regulates blood pressure by inhibiting transforming growth factor TGF-β1 processing. When Emilin-1 is not expressed in vascular smooth muscle cells, Emilin-1 knockout mice are characterized by an increase of TGF-β1 signaling and arteriolar myogenic response. To understand molecular bases of Emilin-1 deficiency in hypertension, we examined the proteomic profiles of aorta and mesenteric arteries in two animal models: constitutive Emilin-1 knockout mouse (KO) and Tamoxifen-inducible vascular smooth muscle cells specific knockout mouse (flox-flox). Wild-type mice and mice Tamoxifen-treated, respectively, were used as controls. Qualitative and quantitative proteomic differences were obtained combining two proteomics techniques: 2D-DIGE (Two Dimensional Differential In Gel Electrophoresis) and ICPL (Isotope-Coded Protein Labeling). To study the transcriptional regulation of the identified differentially expressed proteins, a transcription factor binding sites enrichment analysis was performed. Results indicate that in Emilin-1 KO model there is a general down-regulation of cellular proteins associated with metabolic dysregulation, loss of cytoskeletal proteins and reduction of vascular stiffness. In these mice Emilin-1 gene is expressed neither in smooth muscle nor in endothelial cells and blood vessels are constitutively smaller than controls. These results indicate that the KO model reflects the adaptation of smooth muscle to a congenital hypertension. Emilin-1 flox-flox model shows an up-regulation of some cellular proteins related to energy production, contractile activity and transcription of cytoskeletal and extracellular matrix proteins. In these mice, the conditional silencing of Emilin-1 gene is restricted to smooth muscle cells of blood vessels. The observed molecular alterations demonstrate, in this model, a direct association between hypertension and Emilin-1 deficiency. The transcription factor binding sites enrichment analysis shows that in both models, changes in chromatin structure induce genes expression of contractile markers of vascular smooth muscle cells. These cells may shift their phenotype in response to changes in blood pressure and TGF-β levels. Further progresses will be possible analyzing the pathophysiological mechanisms associated to Emilin-1 deficiency by considering proteomic and transcription factors binding sites enrichment analysis. However, to become relevant for human health, a validation in human subject is mandatory. In this way, these results can promote the identification of new targets for the prevention and/or treatment of hypertension.
proteomics; hypertension; extracellular matrix; Emilin-1
Settore BIO/12 - Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica
LE ALTERAZIONI DELLA MATRICE EXTRACELLULARE NELLA PATOGENESI DELL'IPERTENSIONE: EFFETTI DELLA CARENZA DI EMILINA-1 A LIVELLO DELL'AORTA E DELLE ARTERIE MESENTERICHE DI TOPO / L. Barbalini ; tutor: C. Gelfi ; coordinatore: M. Clerici. - : . DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE PER LA SALUTE, 2015 Jan 20. ((27. ciclo, Anno Accademico 2014. [10.13130/barbalini-laura_phd2015-01-20].
Doctoral Thesis
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