Caratterizzazione delle isoforme di glutammina sintetasi accumulate in radici di piante di mais (Zea mays L.) in risposta a diverse disponibilità di nutrienti azotati

La presenza ed il rapporto fra nutrienti azotati in forma nitrica ed ammoniacale nei suoli agrari rappresenta un fattore predominante nel determinare la crescita, lo sviluppo e la produttività delle specie coltivate. Questi aspetti, insieme allo stato fisiologico e nutrizionale, influenzano infatti l’assorbimento, l’assimilazione e la redistribuzione dell’azoto nell’intera pianta. L’enzima glutammina sintetasi (GS, E.C. 6.3.1.2), che catalizza la fissazione dell’ammonio nel glutammato a formare glutammina, ha un ruolo chiave in tale processo: la GS1 citosolica sostiene prevalentemente il metabolismo dell’ammonio e gli aventi di traslocazione, mentre la GS2 plastidiale risulta coinvolta nell’assimilazione del nitrato. In particolare in mais sono note 5 isoforme di GS1 (c.ca 38 kDa), con diversa espressione tessutale, ed una isoforma di GS2 (c.ca 44 kDa). Lo studio dell’accumulo, della regolazione e delle possibili modificazioni post-traduzionali potrebbe contribuire a chiarire il ruolo fisiologico e le connessioni metaboliche fra le diverse isoforme. In particolare questo studio è stato condotto utilizzando piante di mais allevate in coltura idroponica in assenza di nutrienti azotati fino allo stadio della terza foglia e successivamente esposte per 30 h alle seguenti condizioni: assenza di azoto, nitrato 10 mM, ammonio 10 mM, nitrato 5 mM + ammonio 5 mM. L’incremento nell’assimilazione radicale del nitrato è stato confermato mediante analisi di Western Blotting monodimensionale per l’enzima nitrato reduttasi. Parallelamente le analisi del profilo proteico radicale condotte con un anticorpo per entrambe le isoforme di GS, distinguibili grazie al diverso peso molecolare, ha confermato l’accumulo della GS2 e della GS1 in risposta a nitrato e ammonio, rispettivamente. La caratterizzazione mediante nLC-nESI-MS/MS della banda monodimensionale corrispondente alla GS1 ha evidenziato una differente modulazione delle isoforme nelle condizioni sperimentali, ed in particolare un forte incremento relativo dell’isoforma GS1-5 in risposta all’esposizione ad ammonio 10 mM. Alla luce di questi risultati è stato intrapreso lo studio del profilo radicale mediante Western Blotting bidimensionale, in grado di risolvere le varie isoforme in funzione delle differenze nel punto isoelettrico. Questo approccio ha permesso di isolare 4 spots attribuibili alla GS1 e sorprendentemente 3 spots con peso molecolare corrispondente alla GS2, la cui posizione elettroforetica risulta coerente con la possibile presenza di fosforilazioni. Attualmente è in corso la quantificazione degli spots, la loro caratterizzazione e la verifica delle modificazioni post-traduzionali mediante analisi elettroforetiche e di spettrometria di massa. Ricerca finanziata dal Progetto PRIN 2009, prot. 2009MWY5F9_003