SPHINGOLIPID SIGNALING AS A TARGET IN PHOTORECEPTOR DEGENERATION: AN IN VITRO MODEL FOR THERAPEUTIC STRATEGIES IN RETINITIS PIGMENTOSA

Background: Sphingolipids are a broad class of molecules with the double role of cell membranes components and intra/extra cellular signal mediators, controlling proliferation, differentiation, stress survival and apoptosis. Ceramide (Cer), the core of complex sphingolipids, can undergo deacylation giving rise to sphingosine and sphingosine-1-phosphate (S1P). This latter exerts a pro-survival and proliferative activity, as opposed to Cer, which promotes cell cycle arrest and apoptosis. Retinal degeneration and in particular Retinitis Pigmentosa (RP) are associated to Cer accumulation and cell death induction. In a murine model of RP (rd10 mutant mice), it has been demonstrated that inhibition of Cer synthesis and accumulation, blocking serine palmitoyltransferase (SPT) with Myriocin, rescues retinal photoreceptors, especially cones, from degeneration. Aim: Our aim is to target sphingolipid metabolism to reduce retinal photoreceptor damage, in a cone photoreceptors cell line. In particular, promoting S1P intracellular increase by S1Plyase inhibition and Cer depletion through SPT inactivation. Methods: Murine 661W cone-like cell line were treated with 75µM 2-acetyl-4(5)-(1(R),2(S),3(R),4-tetrahydroxybutyl)-imidazole (THI), an inhibitor of S1Plyase, for 2 hours; next, cells were starved and treated with 1mM H2O2 for different times. Cell growth curve was determined by MTT assay and viability with Trypan blue. TUNEL assay and FRAP test were employed to verify, respectively, apoptosis degree and antioxidant-intrinsic power. Sphingolipid intracellular amounts were measured through LC-MS analysis. ERK1/2 and Akt/PKB phosphorylation, Bcl-2/Bax ratio and Nrf2 expression was evaluated by Western blotting with specific antibodies. Real time-PCR was performed to establish HO-1 and S1P receptors transcript changes upon THI and oxidative stress treatments. Exogenous S1P (100nM) and Myriocin (10µM) were also employed, respectively 1 hour and 5 hours before H2O2, to antagonize oxidative stress effect on photoreceptors. Lastly, we screened 30 new synthetic compounds to determine their ability in inhibiting SPT, through an enzymatic activity assay. Results: We show that enhanced stability of S1P, obtained through THI administration, reduces inhibitory starvation and H2O2 effect on cell proliferation and viability. In particular, through THI ability to reverse stresses-induced ERK1/2 dephosphorylation and Akt phosphorylation on Ser473. We focused our investigations on oxidative stress, finding that THI counteracts H2O2-induced apoptosis increasing Bcl-2/Bax ratio and antioxidant-intrinsic power modulating Nrf2/HO-1 pathway. Furthermore, THI differentially induces S1P receptors transcript expression, showing the major effect on S1P4 and S1P5. In addition, low exogenous S1P improves 661W proliferation, viability and antioxidant response, whereas higher concentration leads to S1P receptors saturation. Myriocin treatment, either alone or in combination with THI, rescues photoreceptors from H2O2-induced oxidative stress and drastically reduces all Cer pools. Simultaneously, we selected three compounds with inhibitory activity on SPT, showing an IC50 values ranging from 17.71µM to 40.41µM. Conclusions: We conclude that S1P stabilization and, in general, sphingolipid metabolism manipulation can be considered a therapeutic target in order to promote photoreceptors survival under different stress conditions, such as oxidative stress.

Introduzione: gli Sfingolipidi sono una vasta famiglia di molecole con il duplice ruolo di componenti strutturali di membrane e mediatori intra ed extra cellulari. Sono implicati nel controllo di proliferazione, differenziazione e sopravvivenza cellulare ma anche di fenomeni legati alla morte, tra cui l’apoptosi. Ceramide (Cer), alla base degli sfingolipidi complessi, può andare incontro a deacilazione generando sfingosina e sfingosina-1-fosfato (S1P). Quest’ultimo è considerato un mediatore di sopravvivenza e proliferazione cellulare, in opposizione a Cer, che promuove arresto del ciclo ed apoptosi. La degenerazione retinica ed, in particolare la Retinite Pigmentosa (RP) sono associate all’accumulo di Cer ed all’induzione di morte cellulare. L’inibizione della sintesi e dell’accumulo di Cer, inattivando la serina palmitoiltransferasi (SPT) attraverso l’utilizzo di Miriocina, è stata dimostrata essere coinvolta nel recupero morfologico e funzionale dei fotorecettori retinici, in particolare dei coni, in un modello murino di RP (mutante rd10). Scopo: Il nostro scopo è di intervenire sul metabolismo degli sfingolipidi per ridurre il danno di fotorecettori retinici, attarveso l’utilizzo di una linea cellulare di fotorecettori coni. In particolare, promuovendo l’aumento di S1P intracellulare, tramite l’inibizione dell’enzima S1P liasi, e la riduzione di Cer attraverso l’inattivazione di SPT. Metodi: le cellule murine 661W, una linea di fotorecettori (coni), sono state trattate con 2-acetil-4(5)-(1(R),2(S),3(R),4-tetraidrobutil)-imidazolo (THI) 75µM, un inibitore dell’enzima S1Pliasi, per 2 ore; quindi, le cellule sono state sottoposte a deprivazione di siero e trattate con H2O2 1mM per differenti lassi di tempo. La curva di crescita di queste cellule è stata determinata attraverso il saggio MTT e la vitalità con Typan blue. Il saggio TUNEL e il FRAP test sono stati impiegati per verificare, rispettivamente, il grado di apoptosi e il potere antiossidante intrinseco dei fotorecettori. I contenuti intracellulari di sfingolipidi sono stati misurati attraverso l’analisi LC-MS. La tecnica del Western blotting, attraverso l’impiego di anticorpi specifici, è stata utilizzata per valutare la fosforilazione di ERK1/2 e Akt/PKB, il rapporto tra Bcl-2/Bax e l’espressione proteica di Nrf2. Attraverso Real time-PCR, le modulazioni nell’espressione dei trascritti di HO-1 e dei recettori di S1P sono stati valutati in seguito a stress ossidativo e trattamento con THI. S1P esogeno (100nM) e Miriocina (10µM) sono stati impiegati, rispettivamente 1 ora e 5 ore prima H2O2, per antagonizzare l’effetto dello stimolo ossidativo sui fotorecettori. In fine, abbiamo esaminato 30 composti di nuova sintesi per determinare la loro capacità inibitoria su SPT, attraverso un saggio di attività enzimatica. Risultati: i nostri risultati mostrano che l’aumentata stabilità di S1P, ottenuta tramite l’utilizzo di THI, è in grado di ridurre l’effetto inibitorio sulla proliferazione e la vitalità cellulare, dato dalla deprivazione di siero e dal trattamento con H2O2. Il pretrattamento con THI, infatti, antagonizza la de-fosforilazione di ERK1/2 e la fosforilazione di Akt su Ser473, indotte dagli stimoli di morte utilizzati. Abbiamo, quindi, focalizzato la nostra ricerca sugli effetti dello stress ossidativo, evidenziando che THI si contrappone all’induzione dell’apopstosi tramite l’aumento del rapporto Bcl-2/Bax e influenza il potere antiossidante intrinseco dei fotorecettori modulando la via di segnale di Nrf2 e HO-1. Inoltre, THI aumenta l’espressione dei recettori di S1P, mostrando un effetto maggiore sui recettori S1P4 e S1P5. Inoltre, abbiamo osservato che basse concentrazioni di S1P migliorano la proliferazione, la vitalità e la risposta antiossidante di cellule 661W, mentre alte concentrazioni portano alla saturazione dei recettori.Il pretrattamento con miriocina, sia da solo che in combinazione con THI, protegge i fororecettori dallo stress ossidativo e riduce drasticamente i livelli intracellulari di tutte le specie di Cer. Parallelamente, abbiamo selezionato tre composti con attività inbitoria su SPT, determinando i rispettivi valori di IC50 che sono risultati essere compresi tra 17,71µM e 40,41µM. Conclusioni: possiamo quindi concludere che la stabilizzazione di S1P e, più in generale, l’azione sul metabolismo degli sfingolipidi è da considerarsi un target terapeutico per promuovere la sopravvivenza fotorecettoriale in differenti condizioni di stress, tra cui lo stress ossidativo.