ASPETTI FUNZIONALI DELL'INTERAZIONE TRA 4.1R E ICLN

The cells are able to adjust its own volume as a result of stress of osmotic nature, thanks to a series of physiological mechanisms that involve different transport systems. In order to counteract the volumetric changes during RVD (Regulatory Volume Decrease), these transport allow exit from the cell of osmotically active substances. One of the mechanisms of greater importance during this process consists in the activation of a chloride current that takes the name of ICl, swell. The multifunctional protein ICln seems to play an important role in the regulation of this current, also interacting with proteins such as the skeletal actin, myosin light chain, JPB1 and protein 4.1 (4.1R), a multifunctional protein localized at the membrane skeletal , able to stabilize the plasma membrane at the level of sub-membranario cytoskeleton and to tie the spectrin-actin complex and ICln via two distinct binding sites. The scope of work is to study the functional consequences of the interaction between the proteins ICln, 4.1R and actin. Experiments were conducted on HEK-293T cells transfected with Phoenix ICln and two different isoforms of 4.1R arising from alternative splicing events (4.1RII from 135 kDa and 80 kDa from 4.1sh) that differ from each other only for the presence or absence of N-terminal region called U1. Initially, through patch-clamp experiments in the whole cell configuration, we have shown how the overexpression short isoform (4.1R80) in HEK293T cells, unlike the long splice variant (4.1R135), stimuli activating the current ICl , swell after stress iposmotico. In order to identify new elements involved in the relationship between cytoskeletal plasticity and cellular responses, through experiments and FRET imaging, we aimed to characterize the role of the interaction between the two proteins by focusing our attention on their location in the cell and the cell morphology (area of ​​adhesion and filopodia). We could then determine that ICln and 4.1R isoforms appear to modify each other their location. Since the arrangement of the proteins in the cell depends on its interaction with the cytoskeleton, were prepared and co-immunoprecipitation experiments of FRET to verify the effect of the interaction ICln 4.1-actin We have also investigated the effect of the two isoforms on cell morphology: the overexpression isoform long, unlike the short, determines an increase of the surface area of ​​the cell showing an increase in the number of filopodia in addition, the overexpression contemporary ICln inhibits the effects of long isoform. Therefore, the two variants of 4.1R, long and short, they seem specialized to perform different functions in the cell. Furthermore ICln is able to influence the location of both isoforms (high and low molecular weight) of 4.1R, but also seems to act as a regulator of their functions, with different effects depending isoform considered.

ICln è una proteina di 209 aminoacidi clonata nel 1992. Componente fondamentale del proteoma cellulare, è una proteina altamente conservata, ubiquitariamente espressa e il suo knock-out è letale. ICln è stata inizialmente associata alla formazione della corrente IClswell, corrente di cloruro attivata in seguito a stress ipo-osmotico e fondamentale per i meccanismi omeostatici di regolazione del volume cellulare. In questi meccanismi, ICln gioca un ruolo di primo piano; infatti è stato dimostrato che anche batteri esprimenti ICln diventano altamente tolleranti a stress di natura ipo-osmotica, mentre l'inibizione della sua espressione provoca una diminuzione dell'IClswell. Nonostante risulti evidente l'importanza di ICln nella attivazione e nella regolazione della corrente, non è ancora chiaro il ruolo molecolare della proteina. In questo senso, l'impossibilità di effettuare un knock-out della proteina risulta essere un ostacolo per la sua caratterizzazione. ICln non è però coinvolta solo nei meccanismi di regolazione omeostatica del volume. Nel corso degli anni, parallelamente ad esperimenti che ne descrivevano i diversi e numerosi partner molecolari, sono state proposte nuove e più ampie funzioni per ICln, riguardanti la regolazione dello splicing e della proliferazione cellulare, della stabilità di membrana e delle interazioni cellulari. Fra le varie proteine in grado di legare con ICln, di particolare importanza sono le interazioni con le proteine citoscheletriche actina, miosina e la proteina 4.1. Quest'ultima è una proteina strutturale, multifunzionale, inizialmente individuata nei globuli rossi e associata alla regolazione della plasticità e 5 resistenza della membrana cellulare. Anche per 4.1, nel corso degli anni, sono state individuati numerosi partner molecolari e numerose funzioni. Inoltre, in aggiunta alla proteina 4.1 inizialmente identificata negli eritrociti, sono state poi individuate varie isoforme presenti in molteplici organi e tessuti. Nel laboratorio dove ho svolto la tesi, in particolare, sono state studiate le due principali isoforme della 4.1 eritrocitica (4.1R): una isoforma ad alto peso molecolare, 4.1R135 di 135 kDa, e una isoforma a basso peso molecolare, 4.1R80 di 80 kDa. Queste due isoforme sono originate dall'utilizzo di due diversi siti di inizio trascrizione e differiscono fra loro unicamente per la presenza o assenza delle regione N-terminale U1, di 209 aminoacidi. In precedenti esperimenti di FRET, coimmunoprecipitazione e western blot si è osservato che le due isoforme sono in grado di interagire con ICln. In particolare i risultati ottenuti sembrano suggerire che tale interazione è in grado di influenzare la localizzazione subcellulare della 4.1R a livello della membrana. Considerando che sia ICln che la proteina 4.1R svolgono funzioni fondamentali a livello di questo distretto subcellulare, scopo del mio lavoro è stato quello di approfondire alcuni aspetti funzionali legati all'interazione fra le due proteine. Si è quindi cercato inizialmente di approfondire l'effetto che svolgono vicendevolmente sulla localizzazione, anche in condizioni d’ipotonia. Inoltre, considerando che la localizzazione di una proteina è dovuta alla sua interazione col citoscheletro e che il citoscheletro di actina, fra l'altro, è fondamentale per l'attivazione dell'IClswell, abbiamo effettuato esperimenti volti a studiare l'effetto di ICln sul legame fra actina e 4.1R. Parallelamente agli esperimenti di localizzazione, abbiamo poi effettuato anche test di proliferazione, esperimenti di patch-clamp ed esperimenti di morfologia cellulare (Correlative Light-Scanning Electron Microscopy) volti ad analizzare il significato funzionale dell'interazione fra ICln e 4.1R, per quanto riguarda la crescita cellulare, il numero di filopodi/area cellulare e l'attivazione e regolazione della corrente IClswell. I risultati ottenuti hanno confermato un effetto di ICln sulla localizzazione e sulla funzione delle due isoforme analizzate di 4.1R. In particolare l'over-espressione di ICln è in grado di determinare anche una variazione di localizzazione a livello della membrana di 4.1R, che si accompagna (per lo meno nel caso della 4.1R135) ad una 6 diminuzione della sua interazione con l'actina. È emerso quindi un quadro complesso di interazioni proteiche che vedono coinvolte ICln, 4.1R e il citoscheletro. Tali interazioni, però, non riguardano solo la modulazione della localizzazione subcellulare delle proteine in esame. Infatti gli esperimenti volti ad analizzarne il significato funzionale hanno mostrato come 4.1R sia in grado di interagire con ICln per modulare l'attivazione dell'IClswell e che entrambe possono regolare la proliferazione e la morfologia cellulare. Un dato interessante che è emerso è stato che le due isoforme di 4.1R non mostrano le medesime funzioni. Già in letteratura è riportato come tali isoforme sono presenti in maniera differente nel corso dello sviluppo degli eritrociti, a testimoniare una differenza nelle funzioni. Negli esperimenti da noi effettuati si è osservato che 4.1R135 e 4.1R80 modulano in maniera differente sia la proliferazione che la morfologia cellulare che l'attivazione dell'IClswell. È possibile quindi immaginare come i meccanismi di splicing possano regolare l'espressione delle diverse isoforme di 4.1R in base alle necessità della cellula. In conclusione è possibile affermare che ICln, interagendo con 4.1R, è in grado di regolarne la funzione. L'interazione porta, infatti, a una rispettiva variazione della localizzazione e alla modulazione di funzioni come l'attivazione della corrente IClswell, la proliferazione e la morfologia cellulare, con effetti diversi per le due isoforme di 4.1R studiate.