SVILUPPO DI METODI IFENATI ASSOCIATI ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA MALDI: APPLICAZIONI PROTEOMICHE E GLICOSFINGOLIPIDOMICHE.

The interest for the development of new methods and the application of hyphenated techniques for complex biological samples characterization is growing, nowadays, more and more. This work faces the application and setup of hyphenated techniques with two aims: a) to identify a new biomarker that can be associated to PSA (Prostate Specific Antigen) for prostate cancer (ADK) diagnosis, b) to develop a hyphenated technique for glycosphingolipids analysis. In clinical proteomics, the identification of new biomarkers is hampered by the discrepancy between the quantitative range of detection of instruments and the concentration range of proteins and peptides in biological fluids. Since the quantitative range of detection of instruments cannot be changed, the critical point is to reduce the dynamic range in examined biological fluids. In serum, this can be obtained by the elimination of high abundant proteins thanks to a selective immunodepletion. The serum low abundant protein fraction from 30 ADK patients and 30 controls was analyzed by MALDI profiling. The applied methodology was able to detect differentially abundant peaks in spectra of ADK vs no ADK controls. To transfer the obtained results in clinical diagnostic, the identification of species revealed by MALDI profiles is mandatory for two main reasons: data validation through the use of immunometric techniques and methodological development for a large scale test. Thanks to the hyphenation between chromatografic techniques, such as gel filtration on a HPLC and reverse phase on a nanoLC, and MALDI mass spectrometry, we were able to identify the highly changed 2021 m/z peak, that corresponds to C3f peptide and that derives from the proteolyses of Complement C3b. To confirm its increment in ADK patients with low PSA values an immunoblotting experiment was conducted. The results were validated on a second group of patients and controls. The increase of C3f expression could be related to a deregulation of C3 complement, cleft to iC3b, that inhibits the selffeeding cycle of the alternative pathway hampering the association of C3b to factor B. Therefore C3f peptide could be used in association to PSA serum value to decrease the number of “false negative”. An important aspect of the biomedical research and, indirectly, of clinical diagnostic is represented by a class of signal molecules that are important in a number of diseases, including neurological and cardiovascular disorders, cancer, lipid storage diseases, and the metabolic syndrome. Despite the increasing clinical interest, glycosphingolipids (GSLs) analysis cannot benefit by high-throughput techniques that allow an easy identification and quantitation of these species, characterized by similar molecular weights. Actually, their characterization is based on radioactive counts after metabolic radiolabeling, or on staining with proper dyes that doesn’t allow a precise quantitation. New approaches including LC-MS are largely used but they are time consuming and operator dependent. We develop the direct hyphenation HPTLC-MALDI, to obtain a precise qualitative and quantitative analysis of the glycosphingolipids profile from murine myoblasts, and to distinguish every fatty acid chain variant for each GSL. An important aspect is that the methodological setup was coupled to biological samples analysis and results were compared to those obtained through the use of radioactive precursors and densitometric analysis on GSLs extracted from wild type and NEU3 overexpressing murine myoblasts. The proposed hyphenation is of great applicability to the glycosphingolipids characterization because it reduces the V analytical steps, it avoids the use of radioactive precursors and silica scraping, and it could be applied to the study of different physiological and pathological conditions to identify potential biomarkers.

L’interesse per lo sviluppo di nuovi metodi e per l’applicazione di tecniche ifenate è generato dalla necessità di caratterizzare campioni biologici complessi. Questo lavoro affronta l’applicazione e la messa a punto di tecniche ifenate allo scopo di: a) identificare un nuovo biomarcatore da associare al PSA (Prostate Specific Antigen) per la diagnostica del cancro prostatico, b) sviluppare una nuova tecnica ifenata per l’analisi di glicosfingolipidi. Negli studi di proteomica clinica, destinati all’identificazione di nuovi biomarcatori, i maggiori problemi sono legati all’incompatibilità dell’intervallo di sensibilità degli strumenti di rivelazione con l’intervallo di concentrazione delle specie proteiche e peptidiche presenti nei fluidi biologici. Pertanto, poiché l’intervallo di sensibilità degli strumenti di rivelazione non può essere variato, il passaggio cruciale è rappresentato dalla riduzione dell’intervallo di concentrazione tra le specie più abbondanti e le specie meno abbondanti nei fluidi biologici in esame. Nel caso del siero ciò è stato ottenuto grazie all’eliminazione della frazione contenente le proteine a maggior abbondanza mediante immunodeplezione selettiva. Le frazioni seriche a bassa abbondanza preparate da 30 pazienti affetti da cancro alla prostata (ADK) e da 30 soggetti controllo sono state analizzate tramite MALDI profiling. La metodica applicata ha permesso di individuare delle differenze statisticamente significative nell’espressione di alcune componenti proteiche, rivelate dalla presenza di picchi differenzialmente espressi negli spettri di massa ottenuti. Tuttavia, il punto fondamentale per il trasferimento dei risultati ottenuti in diagnostica clinica è rappresentato dall’identificazione delle specie proteiche contenute nel profilo di massa MALDI al fine di poter utilizzare tecniche immunometriche per la validazione dei dati e sviluppare metodi di dosaggio su larga scala applicabili in diagnostica clinica. Grazie all’ifenazione tra tecniche cromatografiche, quali la cromatogafia per gel filtrazione e la cromatografia a fase inversa, condotte rispettivamente su uno strumento HPLC e su uno strumento nano LC, e tecniche di spettrometria di massa MALDI, è stato possibile identificare il picco 2021 m/z, statisticamente variato, che corrisponde al peptide C3f, derivato dalla proteolisi del fattore del complemento C3, e la sua aumentata espressione in pazienti ADK+ a bassi valori di PSA, è stata confermata attraverso un esperimento di immunoblotting. I risultati sono stati validati su un secondo gruppo di pazienti e controlli. L’aumento di tale peptide indica una deregolazione del fattore del complemento C3 che viene inattivato a iC3b, il quale inibisce il ciclo della via alternativa del sistema del complemento impedendo l’associazione del fattore C3b al fattore B. Il peptide C3f potrebbe pertanto essere usato in associazione con il valore serico di PSA per ridurre il numero di pazienti “falsi negativi”. Un altro aspetto importante della ricerca biomedica e indirettamente della diagnostica clinica è rappresentato da una classe di molecole di segnale che si sono rivelate importanti in numerose patologie quali malattie cardiovascolari e neurodegenerative, tumori, malattie d’accumulo lisosomiale e sindrome metabolica. Nonostante il crescente interesse clinico, l’analisi dei glicosfingolipidi non gode di tecnologie ad alta automazione che permettano una facile identificazione e quantizzazione di specie con pesi molecolari spesso molto simili. Attualmente tale caratterizzazione avviene tramite l’utilizzo di precursori radioattivi, oppure di coloranti che non permettono una quantizzazione precisa, o di metodi III LC-MS di grande precisione ma dispendiosi in termini di tempo e di coinvolgimento dell’operatore. Attraverso l’ifenazione diretta HPTLC-MALDI, è stato possibile effettuare una fine analisi qualitativa e quantitativa del profilo glicosfingolipidomico estratto da mioblasti murini, distinguendo per ogni glicosfingolipide tutte le varianti a diversa catena di acido grasso presenti. Un aspetto importante è che lo sviluppo metodologico è stato accoppiato ad una analisi di campioni biologici i cui risultati sono stati confrontati con quelli precedentemente ottenuti attraverso l’utilizzo di precursori radioattivi e successiva analisi densitometrica su glicosfingolipidi estratti da mioblasti wild-type e overesprimenti la sialidasi NEU3. Pertanto, l’ifenazione proposta si è rivelata di grande applicabilità alla caratterizzazione dei glicosfingolipidi in quanto riduce i passaggi analitici necessari evitando l’uso di precursori radioattivi e di procedure di estrazione della banda dal gel di silice, e potrà essere applicata allo studio di diverse condizioni fisiologiche e patologiche per identificare potenziali biomarcatori.