MARCATORI MOLECOLARI AD IMPATTO TRASLAZIONALE NEL CARCINOMA EPATOCELLULARE

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a malignant tumor with high morbidity and mortality worldwide. The treatment is based on early diagnosis and individualized therapy. Today surgery is the primary strategy for patients with HCC and Sorafenib, an anti tyrosine kinase drug, represents the only available drug with proven efficacy. The discovery of new molecular markers (diagnostic, prognostic and predictive) that can be translate in the clinical practice represents the improvement in the management of these patients. The present research is aimed at identifying and validating biological markers related to the early HCC diagnosis and to predict HCC relapse. In addition the individual sensibility to pharmacological treatment in patients with advanced HCC is also evaluated. It has been shown that the accuracy of the HCC early diagnosis on the liver biopsy can be significantly improved by combining histological features with molecular markers, recently proposed and applied in the clinical practice. We have optimized this molecular panel for evaluating the contribution of the clathrin heavy chain (CHC), which is an essential component of intra and extracellular vesicular transport, and previously reported as an up-regulated molecule in malignant liver cells. Using a series of small HCC and control precancerous lesions we tested, by immunohistochemical analysis, whether CHC expression contribute to improve the histopathological diagnostic accuracy. We found that the introduction of CHC increases the sensitivity from 46,8% to 63,8% and maintains an absolute specificity. It is now ascertained that hepatocarcinogenesis is based on alterations in a wide variety of molecular pathways controlling oxidative processes and that cytochromes family plays a protective role in this context. Additionally, gene expression profiles have shown that relapse of HCC is caused by some cytochromes deregulations (i.e. CYP1A2). We verified and validated the CYP1A2 role in relation to relapse of disease by immunohistochemistry and its quantification in non-tumoral liver parenchyma. By investigating a homogeneous series of HCC patients with HCV infection and known follow-up, we demonstrated that the CYP1A2 dosage was associated with the recurrence-free survival (p=0,012) in both univariate and multivariate analyses. Moreover, CYP1A2 expression decreased in non-tumoral hepatocytes, the most susceptible background to “de novo” neoplastic transformation, predicted a faster recurrence of disease. The pharmacological therapy of HCC is currently administered to patients with advanced disease, without any discrimination according to the individual drug susceptibility. There is a compelling clinical need to select patients more suitable to underwent pharmacological treatment, because of the elevated cost. Furthemore, there is no still histological and/or serological biomarker, capable to satisfy these requirements. For this reason, we explored whether miRNA, heterogeneous family of regulatory molecules of translation, can be used as new molecular predictive markers of sensitivity to HCC treatment. For this purpose, starting from a wide pool of miRNA, we progressively selected those deregulated and associated with time to progression of disease after treatment. This research was conducted on liver biopsies sampled before treatment in patients treated with Sorafenib. The selection and validation of miRNA were conducted on two distinct series of patients. Among these the second group of patients has been used as a validation set. We identified a single miRNA, with mechanism of action ad genes target unknown, which when appears overexpressed, by real-time PCR analysis, was strongly and statistically associated with prolonged stabilization of tumor disease (p=0,009). The above findings all suggest that the increasing demand for customized markers to optimized the management of HCC patients can be investigated through the application of relatively simple and reproducibly techniques (including immunohistochemistry and real-time PCR) on both tumoral and non-tumoral tissue. Further validation in prospective studies is required to pursue a personalized dosage of new molecular markers to be introduced in the current clinical practice.

L’epatocarcinoma (EC) è un tumore maligno ad elevata morbilità e mortalità la cui speranza di cura è basata su diagnosi precoce e terapia individualizzata. Ad oggi il trattamento di elezione è rappresentato dalla chirurgia e l’unico farmaco con comprovata efficacia terapeutica è un presidio biologico di recente introduzione ad azione anti-tirosinochinasica (Sorafenib). La gestione ottimale del paziente con EC è sempre più influenzata dalla possibilità di disporre di marcatori molecolari da utilizzarsi nella pratica clinica a significato diagnostico, prognostico e predittivo. Il presente lavoro si propone come contributo all’identificazione e validazione di specifici indicatori biologici nella diagnostica del piccolo EC, predizione della recidiva del tumore resecato e della sensibilità individuale alla risposta al trattamento farmacologico nella forma avanzata. E già stato dimostrato che l’accuratezza della diagnosi precoce di EC su biopsia epatica puo’ essere migliorata in maniera significativa dalla valuatazione dell’espressione combinata di alcuni marcatori recentmente proposti e già utilizzati nella pratica clinica. Abbiamo cercato di ottimizzare questo pannello valutando il contributo aggiuntivo della catena pesante della clatrina (CHC) che è componente essenziale nel sistema di trasporto vescicolare intra ed extracellulare, già segnalato come sovraregolato negli epatociti tumorali maligni. Utilizzando una casistica di EC di piccole dimensioni e di lesioni precancerose di controllo e documentando l’espressione della molecola con tecnica immunocitochimica, abbiamo verificato la sua efficacia in termini di accuratezza diagnostica. In particolare l’introduzione di CHC si è dimostrata in grado di incrementare la sensibilità del pannello dal 46,8% al 63,8% a fronte del mantenimento di una specificità assoluta. E’ noto come il processo di carcinogenesi epatica origini anche sulla base di alterazioni delle vie molecolari che governano i processi di tipo ossidativo, con importante ruolo di protezione svolto dalla famiglia dei citocromi. Alcuni studi di espressione genica hanno già evidenziato che la recidiva di malattia tumorale nel fegato sia influenzata dalla disregolazione di alcuni citocromi, tra cui CYP1A2. Abbiamo inteso verificare e validare il ruolo del citocromo CYP1A2 nella qualità di possibile marcatore ad impatto traslazionale nella recidiva dell’EC attraverso il suo dosaggio immuncitochimico nel parenchima epatico non tumorale. Utilizzando una casistica omogenea di pazienti portatori di EC ad eziologia virale (virus C dell’epatite) e a follow-up noto, il dosaggio di CYP1A2 è risultato associato in maniera statisticamente significativa, sia in analisi univariata che multivariata al tempo libero da recidiva tumorale (p=0.012). In particolare la ridotta espressione del citocromo negli epatociti non tumorali, interpretabile come background più suscettibile alla trasformazione neoplastica “de novo”, risultava in grado di predire una più rapida ripresa della malattia. La terapia farmacologica dell’EC è attualmente somministrata a pazienti portatori di forme avanzate senza tenere conto della reale e individuale suscettibilità all’azione del farmaco. Vi è una forte esigenza clinica di selezionare i pazienti candidabili al trattamento anche per gli elevati costi della terapia, ma nessun marcatore, sia esso tissutale o sierologico, si è rivelato ad oggi capace di soddisfare questi requisiti. Abbiamo inteso esplorare se i miRNA, che costituiscono una famiglia eterogenea ma fondamentale di molecole regolatrici della traduzione, potessero a loro volta candidarsi a possibili marcatori biologici di predizione della sensibilità al trattamento farmacologico dell’EC. A questo scopo, partendo da un pool amplissimo di miRNA, abbiamo proceduto ad una loro progressiva selezione sulla base della loro disregolazione nonchè associazione con il tempo di progressione della malattia dopo trattamento. Lo studio è stato condotto su biopsie epatiche pretrattamento di EC di pazienti omogeneamente trattati con Sorafenib. La selezione delle molecole e la validazione delle stesse è stata condotta in due casistiche distinte di cui la seconda utilizzata come coorte di validazione. Abbiamo cosi potuto individuare un unico miRNA con meccanismo di azione e geni targets poco conosciuti, il cui sovradosaggio valutato con tecnica di real-time PCR risultava fortemente e statisticamente associato ad una prolungata stabilizzazione della malattia tumorale (p=0.009). L’insieme di questi risultati dimostra che la crescente domanda di marcatori di medicina personalizzata per ottimizzare la gestione del paziente oncologico (con EC nel nostro caso), possa essere soddisfatta attraverso l’applicazione di tecniche relativamente semplici e riproducibili quali l’immunocitochimica e l’analisi quantitativa del messaggero, condotte sia su tessuti tumorali che non tumorali. Naturalmente affinchè il dosaggio di una molecola possa entrare nella pratica clinica corrente, candidandosi come un autentico marcatore molecolare, è necessaria, come nei nostri casi, un’ulteriore validazione in studi di tipo prospettico.