Strategie innovative per aumentare il passaggio di macromolecole nell'intestino di insetto

Per la somministrazione orale di biopesticidi è di primaria importanza lo studio dei meccanismi di trasporto delle macromolecole attraverso la barriera intestinale degli insetti e lo sviluppo di strategie innovative per facilitarne il passaggio. Utilizzando cellule intestinali in coltura, ottenute dal differenziamento in vitro di cellule rigenerative dell’intestino larvale del lepidottero Bombyx mori, abbiamo verificato la possibilità di potenziare l’ingresso in cellula di proteine modello mediante l’utilizzo di Cell Penetrating Peptides (CPPs). In cellule di mammifero, questi peptidi, formati da non più di 30 residui aminoacidici ricchi di arginina e lisina, superano le membrane plasmatiche veicolando macromolecole ad essi legate. In questo studio sono state utilizzate la proteina ricombinante eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) e la proteina di fusione formata dal CPP Tat e dalla eGFP, espresse e purificate da E. coli. Le cellule in coltura sono state incubate con le due proteine ricombinanti per differenti tempi e quindi fissate e osservate in microscopia confocale. I valori di intensità di fluorescenza calcolati in singole sezioni ottiche acquisite da cellule incubate con Tat-eGFP sono significativamente maggiori rispetto a quelli ottenuti con eGFP per tutti i tempi di incubazione scelti. Le cellule intestinali in coltura crescono e si differenziano in sospensione, quindi durante le incubazioni sia la membrana apicale che quella basolaterale delle cellule sono in contatto con la soluzione contenente le proteine di fusione. Per verificare se la capacità dei CPP di incrementare l’ingresso in cellula della proteina modello coinvolgesse in particolar modo il dominio apicale della membrana plasmatica, ossia quello che in vivo è rivolto verso il lume intestinale, abbiamo eseguito esperimenti con l’intestino medio delle larve di B. mori montato in un opportuno apparato di perfusione. Le proteine ricombinanti eGFP e Tat-eGFP sono state aggiunte nel comparto luminale; dopo 3 ore di incubazione, l’intestino medio è stato tolto dall’apparato sperimentale, fissato e osservato al microscopio confocale. Il citoplasma delle cellule assorbenti degli epiteli incubati con Tat-eGFP presenta una fluorescenza molto maggiore di quella osservata negli intestini incubati con eGFP. Questi risultati indicano che i CPPs sono in grado di potenziare l’internalizzazione della proteina a cui sono legati anche in cellule di insetto e quindi rappresentano un valido strumento per aumentare l’ingresso nelle cellule assorbenti intestinali di proteine ad attività insetticida