PATHOGENETIC DEFINITION OF THE MECHANISMS UNDERLYING THE NOVEL FAMILY OF PLIN4 GENE EXPANSION-RELATED MYOPATHY

PLIN4-related myopathy is a rare vacuolar distal myopathy characterized by late onset and progressive muscle weakness. Currently the disease is associated with two known causative mutations: a 99 nucleotide repeat expansion previously reported and a 14 repeats duplication recently identified. Both rearrangements affect exon 5 of the PLIN4 gene which encodes for the amphipathic helix of perilipin 4, one of the most abundantly expressed perilipin proteins in the skeletal muscle tissue, where it localizes to the subsarcolemmal region of myofibers. These alterations likely lead to protein misfolding and precipitation, resulting in its accumulation within myofibers and vacuoles formation, probably due to progressive aggrephagy impairment. Nevertheless, the exact pathogenic mechanisms of the disease remain to be clarified. Accordingly, one of the aims of this thesis is to unveil the molecular bases of PLIN4-related myopathy by generating in vitro models to recapitulate the muscular environment and disease progression. These models will be used to study aggrephagy and protein aggregates formation, enabling subsequent compounds’ screening. Because primary myoblasts lack perilipin 4 expression, we characterized the previously generated HeLa stable cell lines overexpressing wild-type or mutated perilipin 4. Despite correct protein overexpression, no mutation-induced effects were observed in the cells, even when mimicking disease progression trough autophagy inhibition. The results underscored the necessity for a cell line that more accurately models muscular features. Consequently, I optimized the C2C12 transfection protocol and successfully established C2C12 stable cell lines, which are now being validated. It is hypothesized that muscle energy demands drive perilipin 4 expression and its subsequent translocation to lipid droplets surface, where it can exert its physiological function. Therefore, I am jointly optimizing a protocol to generate a tri-dimensional, contractile muscle organoid model that more accurately recapitulates the complexity of myofibers organization and energetic demands. Upon proper stimulation, the structure could contract, allowing the investigation of perilipin 4 aggregate formation and its potential mechanical disturbance in muscle contraction. Used concurrently, these models have the potential to clarify the molecular basis of this rare myopathy, empowering the generation of a more complex and comprehensive disease model. In the meanwhile, the genetic screening for the identification of new PLIN4 patients is currently ongoing. The testing for exon 5 genetic expansion by PCR amplification, led to the identification of a new sporadic patient carrying a different genetic rearrangement and distinct clinical features compared to the already known cases. The highly repetitive PLIN4 gene can undergo different pathogenic rearrangements, particularly in exon 5, activating the same aggrephagy pathway, yet giving rise to different phenotypic manifestations. This characteristic makes PLIN4-related myopathies challenging to diagnose but suggests that more patients with PLIN4 pathogenic variants are likely still to be discovered. Moreover, the massive screening of undiagnosed cases allowed the identification of different non-pathogenetic deletions hinting the polymorphic characteristic of the gene and its various haplotypes.

La miopatia causata da mutazione nel gene PLIN4 è una rara patologia caratterizzata da esordio tardivo e progressiva debolezza muscolare. Fino ad oggi, sono state identificate due mutazioni causative: un’espansione di blocchi di 99 nucleotidi e una duplicazione di 14 blocchi, identificata recentemente e caratterizzata durante il mio percorso di dottorato. Entrambi i riarrangiamenti interessano l’esone 5 del gene PLIN4 che codifica per l’elica amfipatica della proteina. Perilipina 4 appartiene ad una famiglia di proteine chiamate ‘perilipine’ e risulta maggiormente espressa, oltre che nel tessuto adiposo, anche nel tessuto muscolare scheletrico, localizzandosi nella regione subsarcolemmale delle fibre. I meccanismi patogenetici della malattia non sono noti, ma è probabile che le alterazioni portino ad un problema nel ripiegamento della proteina nella sua forma matura e alla sua precipitazione, con conseguente accumulo all’interno delle fibre e formazione di vacuoli a causa di un deficit nell’aggrefagia. Uno degli obiettivi della mia tesi era proprio indagare i meccanismi patogenetici di questa miopatia tramite prima di tutto la caratterizzazione del materiale biologico disponibile derivato da pazienti e poi tramite la generazione di modelli in vitro con linee cellulari in grado di esprimere stabilmente la forma wild-type o la forma mutata di perilipina 4. L’obiettivo era quello di ottenere un modello cellulare in grado di ricapitolare le caratteristiche della malattia, utilizzandolo per lo studio dell’aggrefagia e della formazione di aggregati proteici. Il modello, una volta validato, verrà utilizzato per lo screening di potenziali composti terapeutici. Poiché i mioblasti primari non esprimono perilipina 4, queste cellule direttamente derivate dai pazienti non possono essere utilizzate per lo studio della malattia. Ho quindi caratterizzato linee stabili in cellule HeLa precedentemente generate. Nonostante la costante over-espressione della proteina, sia nella sua forma canonica sia con mutazione, non ho osservato nessun aggregato proteico o effetto peculiare della malattia. Per questo motivo ho iniziato a lavorare con cellule C2C12, una linea di mioblasti derivati da topo, capaci eventualmente di ricapitolare in maniera più accurata le caratteristiche muscolari. Due linee stabili in cellule C2C12 sono quindi state generate e la validazione di questi modelli è attualmente in corso. In parallelo sto ottimizzando un protocollo per la generazione di un modello tri-dimensionale e contrattile capace di ricapitolare in maniera ancora più accurata la complessa organizzazione della struttura muscolare e i suoi bisogni energetici. Questo contesto, il più vicino possibile a quello fisiologico, potrebbe consentire lo studio della formazione degli aggregati e il loro possibile impatto sulle capacità contrattili della struttura. L’utilizzo congiunto di questi due modelli permetterà lo sviluppo di un modello di malattia più complesso e completo per chiarire le basi molecolari di questa rara miopatia. Nel frattempo, è sempre in corso lo screening genetico per l’identificazione di nuovi pazienti con mutazione in PLIN4. L’analisi dell’espansione genetica dell’esone 5 tramite amplificazione PCR ha portato all’identificazione di un nuovo paziente sporadico, la cui caratterizzazione è stata parte di questa tesi, con una diversa mutazione e con caratteristiche cliniche distinte rispetto ai casi già noti. Il gene PLIN4 possiede una sequenza nucleotidica molto ripetitiva, in particolare nell’esone 5, e può andare incontro a diversi riarrangiamenti patogenetici caratterizzati dall’attivazione dello stesso pathway di aggrefagia, ma dando origine a manifestazioni fenotipiche differenti. Questa caratteristica rende le miopatie correlate a PLIN4 difficili da diagnosticare, ma suggerisce anche che molti pazienti con varianti patogenetiche in questo gene devono ancora essere identificati. Inoltre, lo screening su larga scala di casi non ancora diagnosticati ha permesso l’identificazione di diverse delezioni non patogenetiche, suggerendo la natura polimorfica del gene e l’esistenza di diversi aplotipi.