UNVEILING THE ADVERSE EFFECTS OF POLYSTYRENE NANOPLASTICS IN THE HUMAN-DERIVED HEPG2-OA STEATOTIC-LIKE MODEL, VALIDATING DYSFUNCTIONAL HUMAN-DERIVED SW872 ADIPOCYTE IN VITRO MODELS FOR THE STUDY OF CARDIOMETABOLIC DISEASES, AND ASSESSING TRIMETHYLAMINE N-OXIDE IN A PLIC STUDY SUB-COHORT

Background and aims. Cardiometabolic (CM) and cardiovascular (CV) diseases currently represent the leading cause of mortality worldwide. In recent years, research advances have shed light on novel potential risk factors, involved in both CMDs and CVDs, including polystyrene nanoplastics (PSNPs), a widespread contaminant in the environment and living organism, and Trimethylamine N-oxide (TMAO), a gut microbiota-derived metabolite. PSNPs were found to accumulate in different tissues and organs, including vascular walls, liver, adipose tissue, kidneys and pancreas, exerting potential adverse effects as they accumulate over time. Particularly, PSNPs were found to induce liver steatosis by altering lipid metabolism, based on animal studies, suggesting a role for PSNPs in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease (MASLD). On the other hand, TMAO was found to contribute to atherosclerotic CVD (ASCVD) pathogenesis and development based on in vitro and in vivo models, as it accumulates either in presence of gut dysbiosis and renal impairments or based on certain food consumption. Association studies have also shown strong correlations between high circulating TMAO levels and increased CVD risk. To this aim, TMAO has been quantified exploiting different technological platforms, including proton nuclear magnetic resonance (1H NMR) and mass spectrometry (MS) coupled to high performance liquid chromatography (HPLC). Notwithstanding the robustness of a wide spectrum of analytical methods to measure TMAO from human- derived plasma or serum samples, there is still the need of standardized approach to improve clinical data variability. Moreover, under the light of the strikingly interconnection between CMDs and CVDs and the central role of the adipose tissue in the occurrence of such disorders, modeling dysfunctional adipose tissue recapitulating key features of CMDs has been of considerable interest. Currently, most research relied on the use of animal models, either in vivo or in vitro to model pathological mechanism and driving drug discovery addressing novel therapeutical approaches. However, interspecies-related differences could limit translatability of pre-clinical research into clinical settings. Therefore, the present doctoral thesis aimed at (1) investigating cytotoxic and dysmetabolic effects induced by PSNPs in a human-derived steatotic-like model of hepatocytes, (2) modelling human-derived dysfunctional model of adipocytes recapitulating key CMD traits, and ultimately (3) to develop and validate a robust HPLC-MS/MS analytical method to quantify TMAO from plasma or serum samples. The same method was used to quantify TMAO in a sub-cohort of the PLIC study, encompasses patients in CVD primary prevention. Clinical and anthropometric data, coupled to TMAO quantification were integrated within a machine-learning (ML)-based model to generate personalized CVD risk profiles. Materials and methods. For aim 1: fluorescent and non-fluorescent 500-200-100-20 nm PSNPs were tested at 200-100-10 μg/mL concentrations for 24 and 48 hours in the human- derived hepatoma cell line, HepG2, and in a steatotic-like model of HepG2 cells induced by 100 μM oleic acid for 7 days (HepG2-OA cells). PSNPs-mediated cytotoxic effects were assessed with MTT assay. PSNP uptake and inhibition (only for 500 nm PSNPs) of intracellular internalization via chemical and physical agents were addressed by cytofluorimetric analysis, as well as for dysmetabolic changes, including glucose uptake, and oxidative stress. Moreover, lipid accumulation was explored by light microscopy, and mitochondrial membrane damage with spectrophotometric analysis. For aim 2: human-derived liposarcoma SW872 cell line was selected to obtain 2 distinct dysfunctional models of adipocytes, one induced by 100 μM oleic acid for 7 days (SW872- OA) and the other one via spontaneous differentiation in culture for 17 continuous days (SW872-AUTO). Both models and the control cell line, SW872, were explored by looking at the expression of pharmacologically relevant target genes (qRT-PCR) and glucose transporters at the protein level (immunofluorescence), and by evaluating mitochondrial activity (Seahorse). SW872 and SW872-OA were further investigated via metabolomics analyses (1H NMR) exploiting cell pellets and cell culture media. For aim 3: a stable isotope dilution HPLC-MS/MS analytical method was developed and validated in collaboration with B.S.N. srl, to measure TMAO from either plasma or serum samples. TMAO was specifically measured from plasma samples of a sub-cohort of the PLIC study. Supervised ML-based approach was thereby applied to integrate multiple variables from the PLIC cohort data set, including TMAO quantification, into a modular pipeline using Konstanz Information Miner (KNIME) platform. Results. For aim 1: PSNPs were found to reduce overall HepG2 and HepG2-OA cell viability by 20%. Intracellular internalization of PSNPs occurred in a dose-dependent manner for all the tested sizes, and in a time-dependent manner both cell models, except in HepG2-OA cells after 48 hours of exposure. Cold exposure and nystatin significantly inhibited 500 nm PSNP uptake in HepG2 and HepG2-OA after 3 hours of exposure. PSNP exposure led to impair glucose uptake and mitochondrial membrane potential in both HepG2 and HepG2-OA cells. Oxidative stress production induced by PSNPs was found to increase in a dose- and size- dependent fashion in both cell models. 20 nm PSNPs were observed to induced higher oxidative stress compared to biggest PSNPs in both cell models. Moreover, PSNPs promoted increase accumulation of lipid droplets in HepG2 and HepG2-OA cells. For aim 2: SW872-OA and SW872-AUTO cells showed increased expression of glucose transporters (isoform 1 and 4) both at the gene and protein levels, but reduced translocation to the plasma membrane compared to SW872 cells. Both cell models did not show expression of GLP1R and specular expression of SLC5A2. In addition, SW872-OA and SW872-AUTO cells showed a distinct mitochondrial activity; SW872-AUTO mitochondrial activity diverged the most against control SW872 cells with significant increase of coupling efficiency and spare respiratory capacity. 1H NMR metabolomics revealed altered lipid metabolism in SW872-OA compared to SW872 cells, coupled to inflammatory and adipocyte differentiation-related signatures. For aim 3: Calibration curve of HPLC-MS/MS analytical method to measure TMAO showed high linearity (r2: 0,99997). Coefficient of variation (%CV) for intra-/inter-assay precision resulted below 10%. TMAO measured concentrations from the lowest point of the calibration curve showed a %CV below 12%. Chromatographic run-time was optimized up to 6 minutes. cTMAO median (Q1-Q3) value was 258 (176-417) (ng/mL) in the sub- cohort of the PLIC study. cTMAO weakly contributed to the CVD risk prediction (accuracy: 0.687) in the ML-based predictive model, compared to LDL-C and common carotid intima media thickness (CC-IMT), which were revealed among stronger predictors (accuracy: 0.724; area under the curve: 0.743; CI lower-upper: 0.689-0.79). Conclusions. (1) PSNPs showed to induce cytotoxic and dysmetabolic alterations in a dose- and size-dependent fashion particularly in HepG2-OA cells, suggesting a relevant role for PSNPs in the exacerbation of pathological mechanisms linked to liver diseases, including MASLD. (2) Metabolomic analysis of SW872-OA and SW872-AUTO cells has revealed distinct dysmetabolic signatures and impaired translocation of glucose transporters to the plasma membrane, further valuing these models for their potential applications in CMD and CVD studies, in line with previous assessments. (3) Stable isotope dilution HPLC-MS/MS analytical method to quantify TMAO revealed robustness, precision and high reproducibility following validation and advantageous turnaround time for the analysis, making it suitable for large-scale applications in clinics. ML predictive model revealed TMAO as a weaker CVD risk predictor in the sub-cohort of PLIC patients in CVD primary prevention. Further evaluations in subjects with more severe CVD risk/disease will extend these observations.

Contesto e obiettivi. Le malattie cardiometaboliche (CM) e cardiovascolari (CV) rappresentano attualmente la principale causa di mortalità a livello mondiale. Negli ultimi anni, i progressi della ricerca hanno fatto luce su nuovi potenziali fattori di rischio, coinvolti sia nelle CMD che nelle CVD, tra cui le nanoplastiche di polistirene (PSNPs), agenti inquinanti ampiamente diffusi nell'ambiente e negli organismi viventi, e la trimetilammina N-ossido (TMAO), un metabolita derivato dal microbiota intestinale. È stato osservato che le PSNP si accumulano in diversi tessuti e organi, tra cui pareti vascolari, fegato, tessuto adiposo, reni e pancreas, esercitando potenziali effetti avversi con il loro accumulo nel tempo. In particolare, è stato evidenziato che le PSNP contribuiscono alla steatosi epatica alterando il metabolismo lipidico, sulla base di studi eseguiti su animali, suggerendo un ruolo per le PSNP nella steatosi epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD). D'altra parte, è stato dimostrato che il TMAO contribuisce alla patogenesi e allo sviluppo della malattia cardiovascolare aterosclerotica (ASCVD) sulla base di studi condotti utilizzando modelli in vitro e in vivo, a seguito di innalzamento dei livelli circolanti di TMAO in presenza di disbiosi intestinale e compromissione renale o in base al consumo di determinati alimenti. Studi di associazione hanno anche mostrato forti correlazioni tra elevati livelli circolanti di TMAO e aumento del rischio di malattie cardiovascolari. A tal fine, il TMAO è stato quantificato sfruttando diverse piattaforme tecnologiche, tra cui la risonanza magnetica nucleare protonica (1H NMR) e la spettrometria di massa (MS) accoppiata alla cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). Nonostante la robustezza di un ampio spettro di metodi analitici per misurare il TMAO da campioni di plasma o siero di origine umana utilizzando queste piattaforme, sussiste ancora la necessità di definire un approccio standardizzato per controllare la variabilità dei dati clinici. Inoltre, alla luce della sorprendente interconnessione tra CMD e CVD, e del ruolo centrale del tessuto adiposo nell'insorgenza di tali disturbi, la produzione di modelli di tessuto adiposo disfunzionale, che ricapitoli le caratteristiche chiave delle CMD, è stata di notevole interesse. Attualmente, nell’ambito della ricerca cardiometabolica si usano prevalentemente modelli animali, sia in vivo che in vitro, per modellare meccanismi patologici e guidare l’individuazione di farmaci mirati a nuovi approcci terapeutici. Tuttavia, le differenze interspecifiche potrebbero limitare la traslazione della ricerca preclinica in ambito clinico. Pertanto, la presente tesi di dottorato si è proposta di (1) studiare gli effetti citotossici e dismetabolici indotti dai PSNPs in un modello di epatociti di tipo steatosico di derivazione umana, (2) definire un modello disfunzionale di adipociti di derivazione umana che riepilogasse gli aspetti chiave delle CMD e, infine, (3) sviluppare e validare un robusto metodo analitico in HPLC-MS/MS per quantificare il TMAO da campioni di plasma o siero. Lo stesso metodo è stato utilizzato per quantificare il TMAO in una sotto-coorte dello studio PLIC, che comprende pazienti in prevenzione primaria per malattie cardiovascolari. I dati clinici e antropometrici, associati alla quantificazione del TMAO, sono stati integrati in un modello basato sull'apprendimento automatico (ML) per generare profili di rischio cardiovascolare personalizzati. Materiali e metodi. Per l'obiettivo 1: le PSNP fluorescenti e non fluorescenti da 500-200- 100-20 nm sono state utilizzate a concentrazioni di 200-100-10 μg/mL per 24 e 48 ore nella linea cellulare di epatoma derivata dall'uomo, HepG2, e in un modello di cellule HepG2 steatosiche indotte da 100 μM di acido oleico per 7 giorni (cellule HepG2-OA). Gli effetti citotossici indotti dalle PSNP sono stati valutati con il test di vitalità MTT. L'assorbimento delle PSNP e l'inibizione (solo per le PSNPs da 500 nm) dell'internalizzazione intracellulare tramite agenti chimici e fisici sono stati analizzati mediante analisi citofluorimetrica, così come le alterazioni dismetaboliche, tra cui l'assorbimento del glucosio e lo stress ossidativo. Inoltre, l'accumulo di lipidi è stato esplorato mediante microscopia ottica e il danno alla membrana mitocondriale mediante analisi spettrofotometrica. Per l'obiettivo 2: la linea cellulare SW872 di liposarcoma derivata dall'uomo è stata selezionata per ottenere due distinti modelli disfunzionali di adipociti, uno indotto da acido oleico (100 μM) per 7 giorni (SW872-OA) e l'altro tramite differenziamento spontaneo in coltura per 17 giorni consecutivi (SW872-AUTO). Entrambi i modelli e la linea cellulare di controllo, SW872, sono stati esplorati osservando l’espressione di geni (qRT-PCR) di rilevanza farmacologica e dei trasportatori del glucosio a livello proteico (immunofluorescenza), e valutando l'attività mitocondriale (Seahorse). I modelli cellulari di SW872 e SW872-OA sono stati ulteriormente studiati tramite analisi metabolomica (1H NMR) sfruttando sia i pellet cellulari che i surnatanti dei terreni di coltura cellulare, rispettivamente per ciascun modello. Per l'obiettivo 3: è stato sviluppato e validato un metodo analitico in HPLC-MS/MS basato sulla diluizione con isotopi stabili in collaborazione con B.S.N. srl, per misurare il TMAO da campioni di plasma o siero. Il TMAO è stato misurato specificamente da campioni di plasma di una sotto-coorte dello studio PLIC. Successivamente, è stato utilizzato un approccio basato su ML supervisionato per integrare più variabili dal set di dati della coorte PLIC, inclusa la quantificazione del TMAO, in una pipeline modulare utilizzando la piattaforma Konstanz Information Miner (KNIME). Risultati. Per l'obiettivo 1: è stato riscontrato che le PSNP riducono complessivamente la vitalità delle cellule HepG2 e HepG2-OA del 20%. L'internalizzazione intracellulare delle PSNPs è avvenuta in modo dose-dipendente per tutte le dimensioni testate e in modo tempo-dipendente in entrambi i modelli cellulari, tranne che nelle cellule HepG2-OA dopo 48 ore di esposizione. L'esposizione al freddo e la nistatina hanno inibito significativamente l'assorbimento di PSNPs di 500 nm nelle cellule HepG2 e HepG2-OA dopo 3 ore di esposizione. L'esposizione alle PSNPs ha portato ad una compromissione dell'assorbimento del glucosio e del potenziale di membrana mitocondriale sia nelle cellule HepG2 che nelle cellule HepG2-OA. È stato riscontrato che la produzione di stress ossidativo indotta da PSNPs aumenta in modo dose-dipendente e dimensione-dipendente in entrambi i modelli cellulari. È stato osservato che PSNPs di 20 nm inducono uno stress ossidativo maggiore rispetto alle PSNPs di dimensioni maggiori in entrambi i modelli cellulari. Inoltre, l’esposizione alle PSNPs ha indotto un aumento dell'accumulo di goccioline lipidiche sia nelle cellule HepG2 che nelle cellule HepG2-OA. Per l'obiettivo 2: le cellule SW872-OA e SW872-AUTO hanno mostrato sovra-regolazione dei geni per i trasportatori di glucosio (isoforme 1 e 4), ma ridotta traslocazione a livello delle membrane cellulari. Inoltre, entrambi i modelli non esprimono il gene GLP1R e mostrano un’espressione speculare del gene SLC5A2. Sia SW872-OA e SW872-AUTO hanno mostrato una distinta attività mitocondriale; l'attività mitocondriale delle cellule SW872-AUTO diverge maggiormente rispetto alle cellule SW872, usate come controllo, con un significativo aumento dell'efficienza di accoppiamento e della capacità respiratoria di riserva. L’analisi metabolomica, condotta in 1H NMR, ha rivelato un metabolismo lipidico alterato nelle cellule SW872-OA rispetto alle cellule SW872, associato a segni di infiammazione ed elementi di differenziazione degli adipociti. Per l'obiettivo 3: la curva di calibrazione del metodo analitico HPLC-MS/MS per la misurazione del TMAO ha mostrato un'elevata linearità (r2: 0,99997). Il coefficiente di variazione (%CV) per la precisione intra-/inter-test del medesimo metodo è risultato inferiore al 10%. Le concentrazioni di TMAO misurate al livello del punto più basso della curva di calibrazione ha mostrato un %CV inferiore al 12%. La durata della corsa cromatografica è stata ottimizzata a 6 minuti. Il valore mediano di cTMAO (Q1-Q3) ottenuto è stato il seguente: 258 (176-417) (ng/mL). Nessuna differenza statisticamente significativa è stata osservata correlando i valori di cTMAO con lo spessore della carotide comune (CC-IMT) tra soggetti PLIC di sesso maschile e femminile, rispettivamente con alta e bassa CC-IMT. L’approccio ML supervisionato ha riportato un ridotto potere predittivo (accuratezza: 0.687) rispetto ad altre variabili come LDL-C e CC-IMT (accuratezza: 0,724; area sotto la curva: 0,743; CI inferiore-superiore: 0,689-0,79). Conclusioni. (1) Le PSNPs hanno indotto alterazioni citotossiche e dismetaboliche in modo dose-dipendente e dimensione-dipendente, in particolare nelle cellule HepG2-OA, suggerendo un ruolo rilevante per le PSNPs nell'esacerbazione dei meccanismi patologici legati alle malattie epatiche, inclusa la MASLD. (2) L’analisi metabolomica delle cellule SW872-OA e SW872-AUTO ha rivelato profili dismetabolici distinti e un’alterazione della traslocazione dei trasportatori di glucosio nella membrana cellulare, valorizzando ulteriormente questi modelli cellulari per le loro potenziali applicazioni in studi basati sulle CMD e CVD, in linea con le valutazioni precedenti. (3) Il metodo analitico HPLC-MS/MS basato sulla diluizione con isotopi stabili per quantificare il TMAO si è rivelato robusto, preciso e riproducibile al termine della validazione. Le ridotte tempistiche di analisi per campione risultano vantaggiosi ai fini dell’applicazione del metodo su larga scala in ambito clinico. Il modello predittivo basato su ML ha rivelato che il TMAO è un predittore debole del rischio di malattie cardiovascolari nella sotto-coorte di pazienti PLIC. Ulteriori studi su soggetti con un rischio/malattia cardiovascolare più grave amplieranno queste osservazioni.