Impatto della down-regolazione di wfs1b sui neuroni GnRH3 nel modello in vivo zebrafish

L'ipogonadismo ipogonadotropo congenito (CHH) è un raro disturbo riproduttivo caratterizzato da un difetto nell'ormone di rilascio delle gonadotropine, con conseguente pubertà ritardata o assente. Il CHH presenta un'elevata eterogeneità genetica e fenotipica e, in circa il 50% dei pazienti, l'eziologia resta sconosciuta, suggerendo l'esistenza di geni regolatori non ancora identificati. Nella nostra coorte CHH, abbiamo identificato due varianti missenso in eterozigosi nel gene WFS1, che codifica per wolframina, una proteina coinvolta nell'omeostasi del calcio cellulare e nella risposta allo stress del reticolo endoplasmatico (UPR). Mutazioni in WFS1 sono associate alla Sindrome di Wolfram, caratterizzata da disfunzioni multisistemiche, tra cui anosmia e fertilità ridotta. L'identificazione di varianti genetiche nel gene WFS1 in pazienti con CHH suggerisce un possibile coinvolgimento della wolframina nei vari processi che regolano lo sviluppo e la funzione dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi (HPG). In questo lavoro, abbiamo utilizzato il modello in vivo zebrafish per studiare l'impatto di wfs1b (ortologo umano di WFS1) sulla differenziazione e migrazione dei neuroni GnRH. Esperimenti in vitro sono stati condotti per verificare l'impatto delle due varianti alleliche, identificate tramite sequenziamento dell’esoma, sulla localizzazione subcellulare e sull'espressione della proteina WFS1. Le nostre analisi hanno rivelato che le proteine mutate presentano una minore espressione nel reticolo endoplasmatico e tendono a formare aggregati. Nel modello zebrafish, il knockdown di wfs1b nella linea transgenica (GnRH3:EGFP) ha evidenziato una disorganizzazione neuronale con localizzazione anomala dei neuroni GnRH3 nei bulbi olfattori e nella commissura anteriore. L'analisi dell'espressione dei marker neuronali precoci pax6, ngn1 e isl1a ha rivelato che pax6 e ngn1 erano preservati, mentre isl1a risultava ridotto nei wfs1b morfanti, suggerendo che la sua ridotta espressione possa contribuire ai difetti di migrazione dei neuroni GnRH3. Infine, esperimenti di RT-qPCR su embrioni a 48 ore post-fertilizzazione hanno mostrato un aumento significativo dei livelli di bip, atf6, chop e xbp1 nei wfs1b morfanti, suggerendo l'attivazione della via dell’UPR. I nostri risultati indicano che il knockdown di wfs1b altera la risposta all’UPR, influenzando i neuroni isl1a-positivi e compromettendo lo sviluppo della rete neuronale GnRH3.