Impatto della down-regolazione di wfs1b sui neuroni GnRH3 nel modello in vivo zebrafish

L'ipogonadismo ipogonadotropo congenito (CHH) è un raro disturbo riproduttivo caratterizzato da una carenza o da un difetto d'azione dell'ormone di rilascio delle gonadotropine, con conseguente pubertà ritardata o arrestata. Il CHH presenta una complessa eterogeneità genetica e fenotipica e, in circa il 50% dei pazienti, l'eziologia rimane idiopatica, suggerendo che vi siano ancora geni regolatori da identificare. Nella nostra coorte di pazienti con CHH, abbiamo recentemente identificato due varianti missenso in eterozigosi nel gene WFS1, che codifica per wolframina, una proteina ubiquitaria coinvolta nel folding delle proteine mal ripiegate (UPR), nella regolazione dell'omeostasi del calcio cellulare e nello stress del reticolo endoplasmatico. Mutazioni in omozigosi di WFS1 sono responsabili della "Sindrome di Wolfram", un disturbo multisistemico caratterizzato da disfunzioni visive, perdita dell'udito, anosmia, diabete mellito o insipido, disturbi psichiatrici e fertilità ridotta. L'identificazione di varianti genetiche nel gene WFS1 in pazienti con CHH suggerisce un possibile coinvolgimento della wolframina nei vari processi che regolano lo sviluppo e la funzione dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi (HPG). In questo lavoro, abbiamo utilizzato il modello in vivo zebrafish per studiare l’impatto di wfs1b (ortologo dell’umano WFS1) sulla differenziazione e migrazione dei neuroni GnRH. Esperimenti in vitro sono stati condotti per verificare l'impatto delle due varianti alleliche, identificate tramite sequenziamento dell’esoma, sulla localizzazione subcellulare e sull'espressione della proteina WFS1. Le nostre analisi hanno rivelato che le proteine mutate presentano una minore espressione nel reticolo endoplasmatico e tendono a formare aggregati. Nel modello zebrafish, abbiamo generato un knockdown di wfs1b nella linea transgenica reporter (GnRH3:EGFP) per valutare il ruolo di wfs1b nello sviluppo dei neuroni GnRH3. Tutti gli embrioni wfs1b morfanti (wfs1bMOs) hanno mostrato una disorganizzazione globale dell'architettura neuronale nei GnRH3, con una localizzazione anomala di questi neuroni a livello dei bulbi olfattori e della commissura anteriore. Per valutare il potenziale contributo di wfs1b durante la neurogenesi dei neuroni GnRH3, abbiamo analizzato, tramite tecnica di ibridazione in situ, i marker dei progenitori neuronali che esprimono il fattore di trascrizione pax6 e i precursori neuronali intermedi caratterizzati dall'espressione di ngn1 e isl1a. L’espressione di pax6 e ngn1 è risultata preservata nei wfs1bMOs, mentre, gli embrioni morfanti hanno mostrato differenze nell'espressione di isl1a, suggerendo che la sua ridotta espressione possa contribuire ai difetti di migrazione dei neuroni GnRH3. Dato il coinvolgimento di WFS1 nei meccanismi di risposta nel folding delle proteine mal ripiegate, abbiamo inoltre condotto esperimenti di RT-qPCR su embrioni a 48 ore post fertilizzazione per analizzare l'espressione dei geni coinvolti nelle vie dell’UPR. Le nostre analisi hanno rivelato un aumento significativo dei livelli di bip, atf6, chop e xbp1 nei wfs1bMOs. I nostri risultati suggeriscono che il knockdown di wfs1b attivi la via dell’UPR, influenzando probabilmente i neuroni positivi per isl1a, coinvolti nello sviluppo della rete neuronale dei neuroni GnRH3.