Backgroud. Noncoding RNAs (ncRNAs) are key regulators of several biological processes, and their altered expression and function are associated with tumorigenesis. In this work, we focused on antisense RNAs (asRNAs), which play a critical role in gene expression regulation. Generally thought to modulate their sense genes in cis through sequence complementarity or through the act of transcription, asRNAs can also regulate different molecular targets in trans, in the nucleus or in the cytoplasm. We also explored the role of the alternative polyadenylation (APA) of mRNAs in sustaining tumor aggressive features. Indeed, shortening of the 3’ untranslated region (3’UTR) leads to oncogene activation by microRNA binding site elimination with consequent relief from their repression in cancer cells. We focused on the nuclear transcription factor Y (NF-Y), a master regulator of proliferation in normal and tumor cells. Since its physiological role and involvement in cancer are well-documented, we aimed to study the ncRNA-mediated regulation of NF-Y activity in the development and progression of human cancers. Aims. We aimed to explore the noncoding regulome of the NF-Y transcription factor in human cancer. Specifically, we studied the asRNA NFYC Antisense 1 (NFYC-AS1) and investigated APA of NFYA, which encodes for the regulatory subunit of NF-Y. Results. On the one hand, we molecularly characterized NFYC-AS1 by assessing its expression, transcript structure, and biological function. Moreover, we dissected its mechanism of action by employing different loss-of-function strategies, including Gapmer antisense oligonucleotides (ASOs) and CRISPR/Cas9-mediated deletion of the transcription start site. We reported NFYC-AS1 as a cell cycle-regulating asRNA with a dual mode of action in cis and in trans, exploiting both its transcription- and RNA-dependent functions. On the other hand, we functionally characterized NFYA APA by annotating the 3’UTR isoforms and studying their biological effects on transcript stability, cellular localization, translation efficiency, and microRNA-mediated regulation. Additionally, we manipulated NFYA APA by using both CRISPR/Cas9-mediated deletion of the most used polyadenylation signal (PAS) and ASOs masking the different PASs of NFYA 3’UTR. We demonstrated that APA appeared to be a relevant post-transcriptional mechanism that controls NF-YA activity in cancer. Conclusions. We functionally characterized two distinct noncoding RNA-mediated mechanisms important for the regulation of NF-Y expression and activity. Notably, the emerging application of ASOs in the clinics opens the possibility to target pathogenic asRNAs or mask PASs of deregulated genes in cancer to therapeutically manipulate their protumorigenic activity.

Introduzione. Gli RNA non codificanti (ncRNA) sono implicati nella regolazione di diversi processi biologici, la cui espressione e funzione alterata sono associate a processi di tumorigenesi. In questo lavoro, ci siamo concentrati sugli RNA antisenso (asRNA), che svolgono un ruolo critico nella regolazione dell’espressione genica. Generalmente si pensa che gli asRNA regolino i loro gene senso in cis grazie alla complementarità della sequenza dei due trascritti o tramite l’atto di trascrizione. Tuttavia, gli asRNA possono anche regolare diversi target molecolari in trans, nel nucleo o nel citoplasma. Inoltre, abbiamo studiato il ruolo della poliadenilazione alternativa (APA) degli mRNA nel promuovere caratteristiche aggressive dei tumori. Infatti, l’accorciamento della regione 3’ non tradotta (3’UTR) porta all’attivazione di oncogeni tramite l’eliminazione dei siti di legame dei microRNA, con conseguente riduzione della loro repressione in cellule tumorali. Ci siamo concentrati sul fattore di trascrizione nucleare Y (NF-Y), che ha un ruolo nella regolazione della proliferazione in cellule normali e tumorali. Dato che il suo ruolo fisiologico e il suo coinvolgimento nel cancro sono noti, ci siamo focalizzati sullo studio della regolazione dell’attività di NF-Y mediata da ncRNA durante lo sviluppo e la progressione dei tumori umani. Scopo. Il nostro obbiettivo era quello di esplorare la regolazione del fattore trascrizionale NF-Y mediata da RNA non codificanti nel cancro umano. Nello specifico, abbiamo studiato l’asRNA NFYC Antisense 1 (NFYC-AS1) e l’APA del 3’UTR di NFYA, che codifica per la subunità regolatoria di NF-Y. Risultati. Da un lato, abbiamo caratterizzato a livello molecolare e cellulare NFYC-AS1, valutandone l’espressione, la struttura del trascritto e la funzione biologica. Inoltre, abbiamo analizzato il suo meccanismo d’azione impiegando diverse strategie di silenziamento, ovvero gli oligonucleotidi antisenso (ASO) Gapmer e la delezione del sito di inizio trascrizione tramite la tecnica CRISPR/Cas9. Abbiamo definito NFYC-AS1 come un asRNA coinvolto nella regolazione del ciclo cellulare con un doppio meccanismo d’azione in cis e in trans, sfruttando sia le sue funzioni mediate dalla trascrizione che quelle medi- ate dalla molecola di RNA. Dall’altro lato, abbiamo caratterizzato funzionalmente l’APA di NFYA annotando le isoforme del 3’UTR e studiando i loro effetti biologici sulla stabilità, sulla localizzazione cellulare, sull’efficienza della traduzione del trascritto e sulla regolazione mediata dai microRNA. Inoltre, abbiamo manipolato l’APA di NFYA sia es- eguendo la delezione del segnale di poliadenilazione (PAS) più utilizzato tramite tecnica CRISPR/Cas9, sia usando gli ASO che mascherano i diversi PAS del 3’UTR di NFYA. Abbiamo quindi dimostrato che l’APA è un meccanismo post-trascrizionale importante nel controllare l’attività di NF-YA nel cancro. Conclusioni. Abbiamo caratterizzato funzionalmente due meccanismi distinti mediati da RNA non codificanti, che si sono rivelati importanti per la regolazione dell’espressione e dell’attività di NF-Y. In particolare, le emergenti applicazioni degli ASO nella clinica aprono la possibilità di targhettare gli asRNA patogeni o mascherare i PAS dei geni deregolati nel cancro per manipolare in modo terapeutico la loro attività protumorigenica.

FUNCTIONAL STUDY OF THE NONCODING REGULOME OF THE NUCLEAR FACTOR Y IN HUMAN CANCER / G. Pagani ; supervisor: P. Gandellini. - Università degli studi di Milano, Milano, Italia. Dipartimento di Bioscienze, 2025 Jan 09. 37. ciclo, Anno Accademico 2023/2024.

FUNCTIONAL STUDY OF THE NONCODING REGULOME OF THE NUCLEAR FACTOR Y IN HUMAN CANCER

G. Pagani
2025

Abstract

Backgroud. Noncoding RNAs (ncRNAs) are key regulators of several biological processes, and their altered expression and function are associated with tumorigenesis. In this work, we focused on antisense RNAs (asRNAs), which play a critical role in gene expression regulation. Generally thought to modulate their sense genes in cis through sequence complementarity or through the act of transcription, asRNAs can also regulate different molecular targets in trans, in the nucleus or in the cytoplasm. We also explored the role of the alternative polyadenylation (APA) of mRNAs in sustaining tumor aggressive features. Indeed, shortening of the 3’ untranslated region (3’UTR) leads to oncogene activation by microRNA binding site elimination with consequent relief from their repression in cancer cells. We focused on the nuclear transcription factor Y (NF-Y), a master regulator of proliferation in normal and tumor cells. Since its physiological role and involvement in cancer are well-documented, we aimed to study the ncRNA-mediated regulation of NF-Y activity in the development and progression of human cancers. Aims. We aimed to explore the noncoding regulome of the NF-Y transcription factor in human cancer. Specifically, we studied the asRNA NFYC Antisense 1 (NFYC-AS1) and investigated APA of NFYA, which encodes for the regulatory subunit of NF-Y. Results. On the one hand, we molecularly characterized NFYC-AS1 by assessing its expression, transcript structure, and biological function. Moreover, we dissected its mechanism of action by employing different loss-of-function strategies, including Gapmer antisense oligonucleotides (ASOs) and CRISPR/Cas9-mediated deletion of the transcription start site. We reported NFYC-AS1 as a cell cycle-regulating asRNA with a dual mode of action in cis and in trans, exploiting both its transcription- and RNA-dependent functions. On the other hand, we functionally characterized NFYA APA by annotating the 3’UTR isoforms and studying their biological effects on transcript stability, cellular localization, translation efficiency, and microRNA-mediated regulation. Additionally, we manipulated NFYA APA by using both CRISPR/Cas9-mediated deletion of the most used polyadenylation signal (PAS) and ASOs masking the different PASs of NFYA 3’UTR. We demonstrated that APA appeared to be a relevant post-transcriptional mechanism that controls NF-YA activity in cancer. Conclusions. We functionally characterized two distinct noncoding RNA-mediated mechanisms important for the regulation of NF-Y expression and activity. Notably, the emerging application of ASOs in the clinics opens the possibility to target pathogenic asRNAs or mask PASs of deregulated genes in cancer to therapeutically manipulate their protumorigenic activity.
9-gen-2025
Introduzione. Gli RNA non codificanti (ncRNA) sono implicati nella regolazione di diversi processi biologici, la cui espressione e funzione alterata sono associate a processi di tumorigenesi. In questo lavoro, ci siamo concentrati sugli RNA antisenso (asRNA), che svolgono un ruolo critico nella regolazione dell’espressione genica. Generalmente si pensa che gli asRNA regolino i loro gene senso in cis grazie alla complementarità della sequenza dei due trascritti o tramite l’atto di trascrizione. Tuttavia, gli asRNA possono anche regolare diversi target molecolari in trans, nel nucleo o nel citoplasma. Inoltre, abbiamo studiato il ruolo della poliadenilazione alternativa (APA) degli mRNA nel promuovere caratteristiche aggressive dei tumori. Infatti, l’accorciamento della regione 3’ non tradotta (3’UTR) porta all’attivazione di oncogeni tramite l’eliminazione dei siti di legame dei microRNA, con conseguente riduzione della loro repressione in cellule tumorali. Ci siamo concentrati sul fattore di trascrizione nucleare Y (NF-Y), che ha un ruolo nella regolazione della proliferazione in cellule normali e tumorali. Dato che il suo ruolo fisiologico e il suo coinvolgimento nel cancro sono noti, ci siamo focalizzati sullo studio della regolazione dell’attività di NF-Y mediata da ncRNA durante lo sviluppo e la progressione dei tumori umani. Scopo. Il nostro obbiettivo era quello di esplorare la regolazione del fattore trascrizionale NF-Y mediata da RNA non codificanti nel cancro umano. Nello specifico, abbiamo studiato l’asRNA NFYC Antisense 1 (NFYC-AS1) e l’APA del 3’UTR di NFYA, che codifica per la subunità regolatoria di NF-Y. Risultati. Da un lato, abbiamo caratterizzato a livello molecolare e cellulare NFYC-AS1, valutandone l’espressione, la struttura del trascritto e la funzione biologica. Inoltre, abbiamo analizzato il suo meccanismo d’azione impiegando diverse strategie di silenziamento, ovvero gli oligonucleotidi antisenso (ASO) Gapmer e la delezione del sito di inizio trascrizione tramite la tecnica CRISPR/Cas9. Abbiamo definito NFYC-AS1 come un asRNA coinvolto nella regolazione del ciclo cellulare con un doppio meccanismo d’azione in cis e in trans, sfruttando sia le sue funzioni mediate dalla trascrizione che quelle medi- ate dalla molecola di RNA. Dall’altro lato, abbiamo caratterizzato funzionalmente l’APA di NFYA annotando le isoforme del 3’UTR e studiando i loro effetti biologici sulla stabilità, sulla localizzazione cellulare, sull’efficienza della traduzione del trascritto e sulla regolazione mediata dai microRNA. Inoltre, abbiamo manipolato l’APA di NFYA sia es- eguendo la delezione del segnale di poliadenilazione (PAS) più utilizzato tramite tecnica CRISPR/Cas9, sia usando gli ASO che mascherano i diversi PAS del 3’UTR di NFYA. Abbiamo quindi dimostrato che l’APA è un meccanismo post-trascrizionale importante nel controllare l’attività di NF-YA nel cancro. Conclusioni. Abbiamo caratterizzato funzionalmente due meccanismi distinti mediati da RNA non codificanti, che si sono rivelati importanti per la regolazione dell’espressione e dell’attività di NF-Y. In particolare, le emergenti applicazioni degli ASO nella clinica aprono la possibilità di targhettare gli asRNA patogeni o mascherare i PAS dei geni deregolati nel cancro per manipolare in modo terapeutico la loro attività protumorigenica.
Settore BIOS-08/A - Biologia molecolare
GANDELLINI, PAOLO
Doctoral Thesis
FUNCTIONAL STUDY OF THE NONCODING REGULOME OF THE NUCLEAR FACTOR Y IN HUMAN CANCER / G. Pagani ; supervisor: P. Gandellini. - Università degli studi di Milano, Milano, Italia. Dipartimento di Bioscienze, 2025 Jan 09. 37. ciclo, Anno Accademico 2023/2024.
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