IN SILICO CHARACTERIZATION OF THE RECOGNITION MECHANISM OF RIBOFLAVIN TRANSPORTERS RFVT1, RFVT2, AND RFVT3, AND ORGANIC CATION TRANSPORTERS OCTN1 AND OCTN2

This thesis explores the structural and functional characteristics of solute carrier transporters identified as promising targets for pharmacological purposes. These transmembrane proteins are fundamental players in cell homeostasis and alterations in their expression and function can lead to severe pathological conditions. Because of these reasons, five transporters were specifically chosen to be the focus of this study. In particular, the three riboflavin transporters members of the SLC52 family could be potentially inhibited to decrease riboflavin supply to cancer cells which overexpress these transporters. The two other transporters belong to the SLC22 family (SLC22A4/5) and are specific for a wide array of both endogenous and exogenous organic cations and are also associated with overexpression in cancer cells. Additionally, they have been identified as drug transporters, therefore a thorough characterization of their recognition site can be a useful step to improve drug efficiency. Given the scarcity of experimentally solved structures, in silico methods offer a valuable approach to studying these proteins. Starting from their primary structures, the 3D models of all three transporters were generated using both homology modeling and artificial intelligence-based approaches. The quality of all obtained models was assessed using molecular dynamics simulations to simulate the model behavior in their physiological environment. Once an equilibrated model was obtained, molecular docking was performed to obtain complexes with known transported solutes and inhibitors. These complexes were then used as the starting point of further molecular dynamics simulations to assess protein::ligand interaction energies and the most important residues forming the key interactions. Among the critical results obtained in this thesis, the potential of using short MD simulations and MM/GBSA calculations for in silico drug discovery is particularly noteworthy, as it provides a streamlined approach for evaluating the interactions between compounds and transporters. Additionally, the analysis of the behavior of Na+ ions during the simulation highlighted the presence of a negatively charged glutamate in the transport funnel of OCTN1, a putative key residue for substrate recognition and transport. In conclusion, this thesis advances our understanding of the structure and function of several SLC transporters that are crucial for both normal physiology and disease states. By employing in silico methods such as 3D modeling, molecular dynamics simulations, and molecular docking, we have identified key residues involved in substrate recognition and transport. These findings can inform future studies on the fundamental mechanisms driving transporter function and contribute to the development of drug discovery pipelines targeting these transporters. Finally, the workflows used during this work can provide a framework that can be applied to other solute carrier transporters, facilitating their study and improving our knowledge of these critical proteins.

Questa tesi esplora le caratteristiche strutturali e funzionali dei trasportatori della famiglia SLC (solute carrier), identificati come promettenti bersagli per scopi farmacologici. Questi trasportatori transmembrana sono elementi fondamentali per l'omeostasi cellulare, e alterazioni nella loro espressione e funzione possono portare a condizioni patologiche gravi. Per questi motivi, cinque trasportatori sono stati specificamente scelti come oggetto di studio. In particolare, i tre trasportatori di riboflavina della famiglia SLC52 potrebbero essere inibiti per ridurre l'apporto di riboflavina alle cellule tumorali che sovraesprimono questi trasportatori. Gli altri due trasportatori appartengono alla famiglia SLC22 (SLC22A4/5) e sono specifici per una vasta gamma di cationi organici endogeni ed esogeni. Anche questi trasportatori sono stati osservati essere overespressi nelle cellule tumorali e sono stati identificati come trasportatori di farmaci; quindi, una caratterizzazione approfondita del loro sito di riconoscimento può essere utile per migliorare l'efficacia dei farmaci. Data la scarsità di strutture risolte sperimentalmente, i metodi in silico offrono un approccio prezioso per studiare queste proteine. Partendo dalle loro sequenze primarie, sono stati generati i modelli 3D di tutti e cinque i trasportatori utilizzando modeling per omologia e approcci basati sull’intelligenza artificiale. La qualità dei modelli ottenuti è stata valutata attraverso simulazioni di dinamica molecolare per simulare il comportamento dei modelli nel loro ambiente fisiologico. Una volta ottenuto un modello equilibrato, è stato effettuato il docking molecolare per ottenere complessi con soluti trasportati e inibitori noti. Questi complessi sono stati poi utilizzati come punto di partenza per ulteriori simulazioni di dinamica molecolare, al fine di valutare le energie di interazione proteina::ligando e identificare i residui più importanti coinvolti nelle interazioni chiave. Tra i risultati critici ottenuti in questa tesi, spicca il potenziale uso di brevi simulazioni di dinamica molecolare e calcoli MM/GBSA per la scoperta di farmaci in silico. Questo approccio rappresenta una metodologia semplificata per valutare le interazioni tra composti e trasportatori. Inoltre, l'analisi del comportamento degli ioni Na+ durante la simulazione ha evidenziato la presenza di un glutammato carico negativamente nel canale di trasporto di OCTN1, un possibile residuo chiave per il riconoscimento e il trasporto dei substrati. In conclusione, questa tesi approfondisce la comprensione della struttura e funzione di diversi trasportatori SLC cruciali sia per la fisiologia normale sia per gli stati patologici. Utilizzando metodi in silico come il modeling 3D, le simulazioni di dinamica molecolare e il docking molecolare, sono stati identificati residui chiave coinvolti nel riconoscimento e trasporto dei substrati. Questi risultati possono guidare studi futuri sui meccanismi fondamentali che regolano la funzione dei trasportatori e contribuire allo sviluppo di pipeline per la scoperta di farmaci mirati a questi trasportatori. Infine, i workflow utilizzati in questo studio possono fornire delle pipeline applicabili ad altri trasportatori della famiglia SLC, facilitandone lo studio e ampliando le conoscenze su queste proteine critiche.