IMPACT OF CHOLINE SUPPLEMENTATION ON GENETICALLY MODIFIED MICE: NEW INSIGHTS IN THE MODULATION OF CARDIOVASCULAR RISK

Atherosclerotic cardiovascular disease is the leading cause of death globally. In recent years, scientific evidence has suggested a role of the gut microbiota in the modulation of cardiovascular risk and a major focus has been directed on trimethylamine-N-oxide (TMAO), a gut microbiota-derived metabolite of dietary choline, whose plasma levels are positively correlated with an increased risk of cardiovascular events. This project was aimed at investigating whether different amounts of dietary choline administered to genetically modified mice, prone to atherosclerosis development, would result in further metabolic changes, beyond TMAO production, and to assess whether the gut microbiota shaped by diets with different choline content maintained an intrinsic ability to induce atherosclerosis in mice. Ten-weeks-old atherosclerosis-prone, apolipoprotein E-deficient (EKO) female mice were divided in two groups of 20 animals each and fed for 16 weeks two standard low-fat diets, only differing for their choline content (STD, containing 0.09% choline and HC, containing 1.2% choline). At the end of the dietary treatment, atherosclerosis development, targeted plasma metabolomics, hepatic transcriptome and gut microbiota composition were evaluated. Furthermore, the cecal content of STD and HC mice was transplanted into antibiotic-treated EKO female mice (10 animals/group), which were subsequently fed STD for 16 weeks. At sacrifice, the same analyses performed in STD and HC mice were carried out. Additionally, specific regulatory mechanisms driven by the two choline metabolites, betaine and TMAO, were investigated in vitro, in HepG2 cells. HC diet worsened atherosclerosis development. Interestingly, metabolomic analysis revealed that HC diet, besides increasing TMAO plasma levels, lowered those of homocysteine and increased those of methionine, sarcosine, glycine, carnitine, propionylcarnitine and butyrylcarnitine. Liver transcriptomic analysis supported these metabolic findings, showing that the genes upregulated in HC mice enriched pathways mainly involved in the amino acid and one-carbon metabolism. HC diet mildly modulated gut microbiota composition, and these moderate differences between the microbiota of HC and STD did not differently affect atherosclerosis development in microbiota transplanted mice. However, metabolomic analysis showed a decrease of several plasma triglyceride species in mice that received the microbiota from HC mice, and this result was in line with liver transcriptomic data. In vitro experiments on HepG2 cells suggested a direct modulatory effect of betaine and TMAO on choline-homocysteine-related pathways never described before. In conclusion, the supplementation of dietary choline worsened the development of atherosclerosis, and, additional to TMAO, modified plasma levels of several metabolites playing a role in cardiovascular disease. HC diet mildly modulated gut microbiota, which did not show an increased pro-atherogenic potential, but affected the levels of several plasma lipids, mainly triglycerides. Finally, choline metabolites, tested in vitro, exerted a direct effect on the one carbon metabolism pathway, suggesting new choline-mediated mechanisms implied in atherosclerosis development, which will deserve further investigation.

Le malattie cardiovascolari su base aterosclerotica sono ancora oggi una delle principali cause di morte nel mondo. Negli ultimi anni, evidenze scientifiche suggeriscono un ruolo del microbiota intestinale nella modulazione del rischio cardiovascolare e grande attenzione è stata posta sulla trimetilammina-N-ossido (TMAO), metabolita derivante dal metabolismo della colina da parte del microbiota intestinale, i cui livelli plasmatici sono positivamente correlati con l’aumento del rischio di eventi cardiovascolari. Lo scopo di questo progetto è stato quello di investigare se differenti quantitativi di colina somministrata in topi geneticamente modificati, proni allo sviluppo di aterosclerosi, siano in grado di determinare, oltre alla produzione di TMAO, ulteriori alterazioni metaboliche e verificare se il microbiota intestinale, plasmato dalla dieta con differente contenuto di colina, mantenga un effetto intrinseco nell’indurre l’aterosclerosi nei topi. Topi femmina di 10 settimane di età, proni allo sviluppo di aterosclerosi e deficitari dell’apolipoproteina E (EKO), sono stati suddivisi in due gruppi sperimentali da 20 animali ciascuno e sono stati alimentati per 16 settimane con due diete standard a basso contenuto di lipidi, differenti per il loro quantitativo di colina (STD, contenente lo 0.09% di colina e HC, contenente l’1.2% di colina). Al termine del trattamento dietetico sono state svolte le seguenti analisi: la valutazione dello sviluppo di aterosclerosi, la metabolomica plasmatica targeted, la trascrittomica sul fegato e la valutazione della composizione del microbiota fecale. Inoltre, il contenuto cecale dei topi alimentati con le due diete è stato trapiantato in topi femmina EKO, preventivamente trattati con antibiotici e alimentati a dieta STD per 16 settimane (10 animali/gruppo). Dopo il sacrificio sono state condotte le medesime analisi effettuate nei topi HC e STD. Infine, meccanismi regolatori specifici guidati dai due metaboliti della colina, betaina e TMAO, sono stati investigati in vitro, in cellule HepG2. La dieta ad alta colina peggiora lo sviluppo di aterosclerosi. L’analisi metabolomica dimostra che la dieta HC, oltre ad aumentare i livelli plasmatici di TMAO, riduce i livelli plasmatici di omocisteina e aumenta quelli di metionina, sarcosina, glicina, carnitina, proprionilcarnitina e butirilcarnitina. A supporto di questi risultati metabolomici, l’analisi trascrittomica del fegato mostra che i geni upregolati nei topi HC arricchiscono i pathways principalmente coinvolti nel metabolismo del carbonio e degli amminoacidi. La maggiore assunzione di colina modula lievemente la composizione del microbiota, senza influenzare lo sviluppo dell'aterosclerosi nei topi che hanno ricevuto il trapianto di microbiota. L’analisi metabolomica condotta sui topi trapiantati con il microbiota fecale dei topi HC e STD mostra una riduzione di numerose specie di trigliceridi nei topi che hanno ricevuto il microbiota dai topi HC, e questo risultato è in linea con i risultati ottenuti dalla trascrittomica sul fegato. Esperimenti in vitro sulle cellule HepG2 suggeriscono un effetto modulatorio di betaina e TMAO sul pathway che coinvolge sia la colina che l’omocisteina, mai descritto finora. In conclusione, la supplementazione di colina dietetica peggiora lo sviluppo di aterosclerosi e, oltre ad aumentare i livelli di TMAO, modifica i livelli plasmatici di diversi metaboliti che giocano un ruolo nelle malattie cardiovascolari. Allo stesso tempo, la maggiore assunzione di colina modula leggermente la composizione del microbiota, senza aumentare il suo potenziale pro-aterogeno, ma alterando i livelli di diversi lipidi plasmatici, principalmente trigliceridi. Infine, i metaboliti della colina, testati in vitro, esercitano un effetto diretto sul metabolismo del carbonio, suggerendo nuovi meccanismi mediati dalla colina implicati nello sviluppo di aterosclerosi, che meriterà ulteriori indagini.