INVESTIGATING GENOME PROTECTION AT G-QUADRUPLEXES: STRUCTURAL-FUNCTIONAL ANALYSIS OF S. CEREVISIAE DOMESTICATED TRANSPOSASE VID22

Genome instability is a characteristic feature of ageing and several human pathologies, including cancer. Genome instability is elicited by exogenous DNA damaging agents and by multiple endogenous factors, among which G-quadruplex non-canonical DNA secondary structures. These structurally heterogeneous nucleic acid folds have been implicated in the modulation of multiple biological processes, including transcription and replication. Consequently, perturbation of G-quadruplex homeostasis is linked to alterations in gene expression, replication stress, DNA breakage, and, ultimately, enhanced genome instability. We recently found that Saccharomyces cerevisiae Vid22, a putative member of the hAT family of DNA transposases by prediction of a BED-type zinc finger domain and an RNase H fold, binds at G-quadruplex forming sites and counteracts their detrimental effects on genome stability. In this work, I mutated various residues of Vid22 protein or the DNA sequence of one of its binding loci in the genome to investigate the intrinsic and extrinsic requirements for its recruitment to chromatin. Vid22 enrichment at certain loci depends on the presence of a G-quadruplex and contributes to the binding of Tbf1, a multifunctional general regulatory factor, to DNA. Moreover, Vid22 role in genome protection correlates with its physical interaction with Tbf1. Disruption of the putative DNA-binding BED domain only partially affects Vid22 interaction with DNA and Tbf1, whereas mutation of C-terminal residues abolishes both processes and correlates with cell hypersensitivity to genotoxic stress. Moreover, Vid22 forms homodimers in vivo. The computational model and low-resolution structure of Vid22 dimer display striking similarities to that formed by the active hAT Hermes transposase dimer despite their evolutionary distance and sequence divergence. Similarly to Hermes, Vid22 C-terminus seems to be crucial in maintaining the proper protein tertiary structure. Mutation of the C-terminus also abolishes Vid22 self-interaction due to its spatial proximity to a second putative DNA-binding region directly involved in dimerisation (residues 170-210) inferred by homology to Hermes, which existence is corroborated by the impairment of self-interaction in the vid22 F195A mutant. Thus, Vid22 has evolved from the domestication of a hAT DNA transposase to support genome stability and G-quadruplex regulation in budding yeast. Because the human genome also encodes uncharacterised proteins predicted to possess similar domain organisation and evolutionary origin, research on Vid22 may pave the way for their study, besides providing novel insights into G-quadruplex recognition and biology.

L'instabilità del genoma è una caratteristica distintiva dell'invecchiamento e di varie patologie umane, tra cui il cancro. L'instabilità genomica è provocata da agenti esogeni che danneggiano il DNA e da molteplici fattori endogeni, tra cui le G-tetradi, strutture secondarie non canoniche del DNA. Queste strutture eterogenee sono state implicate nella modulazione di numerosi processi biologici, inclusi la trascrizione e la replicazione. Di conseguenza, la perturbazione dell'omeostasi delle G-tetradi è associata ad alterazioni nell'espressione genica, a stress replicativo, a rotture del DNA e, in ultima analisi, a un aumento dell’instabilità del genoma. Abbiamo recentemente scoperto che la proteina Vid22 di Saccharomyces cerevisiae, un presunto membro della famiglia hAT di DNA trasposasi in base alla predizione di un motivo a dito di zinco di tipo BED e un ripiegamento simile alla ribonucleasi H, lega alcuni siti formanti G-tetradi e contrasta i loro effetti negativi sulla stabilità del genoma. In questo lavoro, ho mutato vari residui della proteina Vid22 o la sequenza di DNA di uno dei suoi siti di legame nel genoma per investigare i requisiti intrinseci ed estrinseci per il suo reclutamento alla cromatina. L'arricchimento di Vid22 in certi loci dipende dalla presenza di una G-tetrade e contribuisce al legame al DNA di Tbf1, un fattore regolativo generale multifunzionale. Inoltre, il ruolo di Vid22 nella protezione del genoma è correlato alla sua interazione fisica con Tbf1. La distorsione del motivo a dito di zinco di tipo BED, putativo dominio di legame al DNA, affligge solo parzialmente l'interazione di Vid22 con il DNA e Tbf1, mentre la mutazione di residui C-terminali abolisce entrambi i processi e correla con ipersensibilità cellulare a stress genotossici. Inoltre, Vid22 forma omodimeri in vivo. Il modello computazionale e la struttura a bassa risoluzione del dimero di Vid22 mostrano somiglianze sorprendenti con quello formato da Hermes, trasposasi attiva della famiglia hAT, nonostante la loro distanza evolutiva e la divergenza di sequenza. Analogamente a Hermes, il C-terminale di Vid22 sembra essere cruciale nel mantenimento della corretta struttura terziaria della proteina. La mutazione del C-terminale abolisce anche l'interazione Vid22-Vid22 a causa della sua prossimità spaziale a una seconda regione putativa di legame al DNA direttamente coinvolta nella dimerizzazione (residui 170-210), inferita per omologia con Hermes, la cui esistenza è corroborata dalla compromissione dell'auto-interazione nel mutante vid22 F195A. Pertanto, Vid22 origina evolutivamente dalla domesticazione di una DNA trasposasi della famiglia hAT a supporto della stabilità del genoma e della regolazione delle G-tetradi nel lievito gemmante. Poiché anche il genoma umano codifica proteine poco caratterizzate che sono predette possedere un’organizzazione di domini e un'origine evolutiva simili, la ricerca su Vid22 potrebbe gettare le basi per il loro studio, oltre a fornire nuove informazioni sul riconoscimento e sulla biologia delle G-tetradi.