INTERACTOMICS FOR RICE FLOWERING: A PROXIMITY LABELLING APPROACH

Flowering regulation in rice (Oryza sativa) involves a complex induction pathway that senses environmental inputs in the leaves and transmits signals to the shoot apical meristem (SAM) for reproductive differentiation. The transcription factor Hd1, homologous to Arabidopsis CONSTANS, is pivotal photoperiodic sensor, promoting flowering under short-day (SD) and repressing it under long-day (LD) conditions. Hd1 function is modulated through the interaction with other flowering regulators, such as Ghd7 and NF-Y proteins, to activate or repress the transcription of the florigen genes Hd3a and RFT1. A recently characterized florigen-like protein, called FTL1, contributes to meristem differentiation during inflorescence and panicle development, relying on interactions with OsFD transcription factors. During my PhD, I studied Hd1 and FTL1 function with traditional transcriptional and biochemical techniques, as well as through innovative proteomic approaches. Proximity Labelling (PL) was employed for the first time in our laboratory to explore novel protein-protein interaction of Hd1 and FTL1. PL relies on fusing TurboID (TbID), an optimized biotin ligase, to the protein of interest to obtain specific tagging of its interactors in vivo. Identification of the proximal proteome is enabled by selective precipitation of biotinylated proteins and mass spectrometry analysis. Our research has established an efficient PL protocol in agroinfiltrated N. benthamiana leaves and transgenic rice plants expressing TbID-fused proteins. TbID-fused FTL1 and Hd1 were successfully created, and protein analyses confirmed their stability and enzymatic efficiency, helping refining the optimal PL pipeline. A preliminary PL analysis was carried out on Hd1-TbID using agroinfiltrated N. benthamiana leaves. Furthermore, application of PL on rice FTL1-TbID floral meristems yielded >3000 proteins, with 102 identified as potential FTL1 interactors, revealing associations with chromatin, RNA metabolism, and cell structural elements (cell wall, plasmodesmata and microtubules). Ongoing research promises additional proteomic information, while validation experiments are underway to verify the novel information retrieved on FTL1 localization and function. With these experiments, we demonstrate that PL can expand our understanding of rice flowering regulating network, and that the obtained data can be a valuable resource to maximize the breeding of cultivated rice varieties.

Il controllo della fioritura nel riso (Oryza sativa) si snoda su un complesso meccanismo di induzione che integra gli stimoli ambientali nelle foglie e trasmette un segnale al meristema apicale della pianta per indurne la transizione riproduttiva. Il fattore di trascrizione Hd1, omologo di CONSTANS in Arabidopsis, è un sensore fotoperiodico che promuove la fioritura in condizioni di giorno corto (SD) e la reprime in condizioni di giorno lungo (LD). Hd1 interagisce con altri regolatori della fioritura, come Ghd7 e le proteine di tipo NF-Y, per attivare o reprimere la trascrizione dei geni florigenici Hd3a e RFT1. Una proteina florigenica di recente caratterizzazione, chiamata FTL1, contribuisce alla differenziazione del meristema durante lo sviluppo dell'infiorescenza e della pannocchia, interagendo con i fattori di trascrizione di tipo OsFD. Durante il mio dottorato ho studiato Hd1 e FTL1 con tecniche di analisi proteica e trascrizionale, oltre che con approcci proteomici innovativi. Per la prima volta nel nostro laboratorio, abbiamo utilizzato il proximity labelling (PL) per esplorare le interazioni di Hd1 e FTL1 con altre proteine. Il PL si basa sulla fusione della TurboID (TbID), una biotin-ligasi ottimizzata, alla proteina di interesse con lo scopo di marcarne gli interattori in vivo. L'identificazione del cosiddetto proteoma prossimale è resa possibile dalla precipitazione selettiva delle proteine biotinilate e dalla successiva analisi di spettrometria di massa. Con il nostro lavoro abbiamo sviluppato un efficiente protocollo di PL su foglie di N. benthamiana agroinfiltrate e in piante di riso transgeniche che esprimono le suddette proteine di fusione. Le analisi preliminari su Hd1-TbID e FTL1-TbID hanno confermato la loro stabilità ed efficienza enzimatica. Successivamente, l’intero protocollo di PL è stato applicato su Hd1-TbID utilizzando foglie di N. benthamiana agroinfiltrate. Inoltre, l'impiego del PL su meristemi florali di riso esprimenti FTL1-TbID ha identificato più di 3000 proteine, di cui 102 sono candidate come interattori di FTL1 e lo associano alla cromatina, al metabolismo dell'RNA ed agli elementi strutturali della cellula (parete cellulare, plasmodesmi e microtubuli). Attualmente sono in corso degli esperimenti di convalida di queste potenziali interazioni di FTL1, finora sconosciute. Con questi esperimenti dimostriamo l’ampio raggio dei dati ottenuti mediante il PL, e che le nuove e dettagliate informazioni sullo sviluppo fiorale possono essere una risorsa preziosa per il miglioramento varietale del riso.