La capacità di migrazione delle cellule di neuroblastoma umano è direttamente correlata all'espressione della proteina doublecortin, marker dell'aggressività tumorale

Il neuroblastoma è il più frequente tumore solido extracranico dell’età pediatrica. Si origina dalle cellule della cresta neurale in fase di sviluppo, durante il loro percorso migratorio all’interno e lungo le corde spinali, la catena simpatica, l’aorta e le ghiandole surrenali. Alcuni stadi del tumore sono caratterizzati da un elevato grado di metastatizzazione e non possono essere trattati chirurgicamente, per cui si ricorre a trattamenti chemioterapici associati all’utilizzo dell’acido retinoico (RA). Risultati precedenti, ottenuti nel nostro laboratorio, dimostrano che la linea di neuroblastoma umano SK-N-SH esprime, per quanto riguarda la componente neuronale della linea (N-type cells), la proteina doublecortin (DCX) e che la sua espressione viene modulata negativamente dal trattamento con RA. Come è noto, DCX è una proteina associata ai microtubuli, che influenza fortemente la capacità di migrazione delle cellule, la nucleocinesi ed altri meccanismi, ancora in fase di studio, legati al corretto funzionamento del citoscheletro. Recentemente, è stato riportato in bibliografia che il grado di aggressività del neuroblastoma può essere correlato ai livelli di espressione di DCX (Oltra S. et.al, Diag. Mol. Pathol.,14:53, 2005). Volendo approfondire l’analisi sul ruolo svolto da DCX in questo contesto, si è analizzato, mediante immunofluorescenza, l’espressione di altre proteine correlate al funzionamento del citoscheletro e all’aggressività tumorale. In particolare, si è considerato l’espressione di LIS1, tubulina, vimentina e della proteina Neurofilamento-68 (NF-68). L’analisi della localizzazione di queste proteine, mediante immunofluorescenza, è stata effettuata anche su cellule trattate con RA 10 µM per 6 giorni. La quantizzazione dell’espressione proteica è stata effettuata mediante western blotting. Inoltre, nell’intento di valutare influenze sulla capacità migrante delle cellule di neuroblastoma e l’effetto del trattamento con acido retinoico, sulla modalità di espressione di DCX, sono state effettuate analisi mediante la tecnica definita di “scratch”(Yarrow JC, et al., BMC Biotec.,4:21,2004), Questo test innovativo consente di verificare quale tipo cellulare e quali proteine sono espresse nelle cellule che migrano o che non migrano, e rende possibile monitorare la migrazione cellulare nel tempo tramite esperimenti di time-lapse. I risultati ottenuti indicano che: 1) le cellule di tipo neuroblastico, che esprimono DCX, non sono immunoreattive per vimentina; 2) NF-68 è espresso, oltre che dalle cellule di chiara morfologia neuroblastica, immunoreattive per DCX, anche da cellule con morfologia fibroblastico-epiteliale che esprimono vimentina; 3) dopo il trattamento con RA 10 µM per 6 giorni, diminuiscono le cellule di morfologia neuroblastica che esprimono DCX, mentre aumentano quelle immunoreattive per vimentina. Tuttavia la quantizzazione mediante western, non indica un aumento dei livelli di questa proteina a seguito del trattamento con RA, probabilmente per una concomitante diminuzione osservata nelle cellule di tipo fibroblastica epiteliale; 4) l’analisi della migrazione mediante scratch test dimostra che, a seguito del trattamento con RA, la capacità di migrazione delle cellule SK-N-SH si riduce; 5) le poche cellule che dopo il trattamento con RA continuano ad esprimere DCX presentano ancora elevata capacità di migrazione. Quindi, dai risultati presentati si può concludere che la proteina DCX, potenziale marker per il neuroblastoma, è espressa dalla componente cellulare più invasiva e tumorigenica della linea SK-N-SH. L’acido retinoico diminuisce l’espressione di DCX inducendo, nei neuroblasti, l’espressione di vimentina e, quindi, riduce oltre che la tumorigenicità delle cellule, come indicato da Ross (Ross et al., Canc. Cell., 197:35,2003) anche la loro capacità migratoria in vitro. (Progetto FIRB: RBAU01FXRT)