ORIGINE E DISPERSIONE DI WNV-2 IN ITALIA DAL 2011 AL 2018: RICOSTRUZIONE FILOGENETICA E FILOGEOGRAFICA

The present thesis, developed in collaboration with the Policlinico San Matteo in Pavia and the Zooprophylactic Institute of Lombardia and Emilia Romagna, is focused on the epidemiology of West Nile virus (WNV), an emerging pathogen globally widespread, affecting all continents, with the only exception of Antarctica. Today WNV represents an important public health problem, being able to cause lethal neurological pathologies, especially in the most fragile sections of the population, such as the elderly and chronic patients. To date, 9 viral lineages have been described, whose lineages 1 and 2 represent the main pathogens for human beings. WNV-1 can be found all over the World except for Antarctica; WNV-2, initially isolated in Sub-Saharan Africa and Madagascar, first appeared in Italy in 2011 and it currently seems to be the only lineage circulating in our territory. In accordance with the epidemiological data recorded by the ECDC, 1832 human cases of this disease were recorded in the period 2011-2017 in several countries of European Union, closer to each other. In 2018, the transmission of the virus in Italy and in other European countries started earlier and in just one season the number of cases in human beings equaled those that occurred in the previous 7 years. In our country alone, since June 2018, 577 infection cases in humans had been reported, with 230 neuro-invasive events and a total of 42 deaths. Furthermore, there was evidence of high viral circulation in mosquitoes and birds that represent respectively the vector and the virus reservoir. Since no vaccine is currently available for use in humans, surveillance activities, established and regulated by the "Integrated National Surveillance and Response Plan to West Nile and Usutu Virus - 2019", are of main importance. It is in this context that this work is inserted, aiming at reconstructing the epidemiological history of the virus through the use of advanced bioinformatic and phylogenetic approaches. During these three years of research, the West Nile strains circulating in Italy in the summer-autumn seasons between 2013 and 2018 were collected; after the optimization of the amplification protocols of the entire viral genome, these strains were characterized by Next Generation Sequencing (NGS) technologies. The sequences obtained were analyzed in order to search important mutants from an epidemiological or pathogenetic point of view; moreover a study of molecular evolution of the viral genome and the forces that guide its evolution, has been done in relation to space and time. Through the application of phylogenetic models our research group tried to reconstruct the history of WNV-2 from the time of its first isolation to the present, using the home-made genomes and those deposited in public databases at the beginning of the study, accompanied by information relating to the year and place of isolation. The use of a phylogeographic approach allowed us, on the basis of the knowledge of the place of isolation of the sequences included in the analysis, to reconstruct the most probable location of the internal nodes of our tree, and to estimate the geographical spread of the virus, in real time scale. In order to study the dynamics of viral propagation, phylo-epidemiological models have also been used which has allowed us to estimate important parameters such as the actual reproductive number (Re) and its changes over time. Interesting results, recently published by our group, have been obtained on the circulation of WNV-2 in our country. The phylogenetic reconstruction confirmed the entry of the virus in Italy in 2008 and highlighted the simultaneous circulation of two variants, one of which apparently became extinct in 2013–2014 Furthermore, the observation of the existence of different significant groups within the variant still circulating in 2018, suggested the presence of endemic strains and supports the hypothesis that the endemic virus is maintained alive between one summer season and another through different possible overwintering mechanisms. The methods used in philodynamics and phylogeography are particularly suitable for the reconstruction of the history of emerging infections, such as arbovirosis like West Nile virus, providing useful information for surveillance. Therefore, in the future, in order to better understand the origin and the spread of the virus, we intend to improve the quality of epidemiological data available through the implementation of molecular methods, for an earlier identification of the viral circulation, and the development of a network of skills and collaborations with different professional figures. In this way we will able to clarify the complex epidemiological cycle of the virus.

La presente tesi di dottorato, sviluppata in collaborazione con il Policlinico San Matteo di Pavia e l’Istituto Zooprofilattico della Lombardia e dell’Emilia Romagna, è incentrata sulla epidemiologia del virus di West Nile (WNV), un patogeno emergente che rappresenta il flavivirus più diffuso a livello globale, essendo presente in tutti i continenti, con la sola esclusione dell’Antartide. WNV rappresenta oggi un importante problema di salute pubblica, potendo causare patologie neurologiche potenzialmente letali soprattutto nelle fasce più fragili della popolazione, come gli anziani e i malati cronici. Ad oggi sono descritti 9 lineages virali, di cui l’1 e il 2 rappresentano i principali patogeni per l’uomo. WNV-1 è diffuso in tutto il Mondo eccetto l’Antartide; WNV-2, isolato inizialmente in Africa Sub-Sahariana e in Madagascar, dal 2011 è comparso in Italia e attualmente sembrerebbe essere l’unico lineage circolante nel nostro territorio. In accordo con i dati epidemiologici riportati dall’ECDC, 1832 casi umani di malattia neuro-invasiva sono stati registrati nel periodo 2011-2017 nei Paesi membri dell’Unione Europea e nelle Nazioni limitrofe. Nel 2018, la trasmissione del virus in Italia e in diversi Paesi europei è iniziata precocemente e ha causato in una sola stagione un numero di casi nell’uomo pari a quelli che si sono verificati nei 7 anni precedenti. Solo nel nostro Paese, da Giugno 2018 sono stati segnalati 577 casi umani confermati di infezione, di cui 230 si sono manifestati nella forma neuro invasiva e 42 sono deceduti. Inoltre, è stata evidenziata una elevata circolazione nelle zanzare e negli uccelli, che rappresentano rispettivamente il vettore e il serbatoio del virus. Non essendo disponibile attualmente alcun vaccino per l’uso nell’uomo, di fondamentale importanza risultano le attività di sorveglianza di questa importante arbovirosi, istituita e regolamentata dal “Piano Nazionale integrato di sorveglianza e risposta ai virus West Nile e Usutu - 2019”. E’ in questo contesto che si inserisce il presente lavoro, finalizzato alla ricostruzione della storia epidemiologica del virus attraverso l’utilizzo di approcci bioinformatici e filogenetici avanzati. Nel corso di questi tre anni di attività di ricerca sono stati collezionati i ceppi di West Nile circolanti in Italia nelle stagioni estivo-autunnali 2013- 2018; dopo una messa a punto dei protocolli di amplificazione dell’intero genoma virale, questi ceppi sono stati caratterizzati tramite tecnologie di Next Generation Sequencing (NGS). Le sequenze ottenute sono state analizzate alla ricerca di mutanti importanti da un punto di vista epidemiologico o patogenetico, ed è stato condotto uno studio di evoluzione molecolare del genoma virale e delle forze che ne guidano l’evoluzione, in relazione allo spazio e al tempo. Attraverso l’applicazione di modelli filogenetici il nostro gruppo di ricerca ha cercato di ricostruire la storia di WNV-2 dal momento del suo primo isolamento ad oggi, utilizzando i genomi home-made e quelli depositati in banche dati pubbliche alla data di inizio dello studio, corredati di informazioni relative all’anno e al luogo di isolamento. L’utilizzo di un approccio filogeografico ci ha consentito, unicamente sulla base della conoscenza del luogo di isolamento delle sequenze incluse nell'analisi, di ricostruire la località più probabile dei nodi interni del nostro albero, e di stimare la diffusione geografica del virus, in scala di tempo reale. Allo scopo di studiare le dinamiche di propagazione virale sono stati anche utilizzati modelli filo-epidemiologici che permettono di stimare importanti parametri, quali il numero riproduttivo effettivo (Re) e i suoi cambiamenti nel tempo. Interessanti risultati, pubblicati recentemente dal nostro gruppo, sono stati ottenuti sulla circolazione di WNV-2 nel nostro Paese. La ricostruzione filogenetica ha confermato l’ingresso del virus in Italia nel 2008 e ha evidenziato la contemporanea circolazione di due varianti, una delle quali sembrerebbe essersi estinta nel 2013/2014. Inoltre, l’osservazione della esistenza di differenti gruppi significativi all’interno della variante ancora circolante nel 2018, ha suggerito la presenza di ceppi endemici e supporta l’ipotesi che il virus endemico sia mantenuto tra una stagione estiva e l’altra attraverso diversi possibili meccanismi di “overwintering”. I metodi utilizzati di filodinamica e filogeografia sono risultati particolarmente adatti alla ricostruzione della storia di infezioni emergenti, come l’arbovirosi da West Nile, potendo fornire informazioni utili alla sorveglianza. Pertanto, ci proponiamo in futuro, al fine di comprendere al meglio l’origine e le modalità di diffusione del virus, di migliorare la qualità dei dati epidemiologici disponibili, attraverso l’implementazione di metodi molecolari, per una più precoce individuazione della circolazione virale, e lo sviluppo di una rete di competenze e di collaborazioni con figure professionali diverse per fare chiarezza sul complesso ciclo epidemiologico del virus.