Effetti della stimolazione con onde d’urto defocalizzate su colture di cellule endoteliali microvascolari umane (hmec – 1)

Le onde d’urto defocalizzate (uSW) sono in grado di stimolare la rigenerazione cutanea ed il trofismo tissutale, principalmente attivando i processi di neoangiogenesi, i cui dettagli, pero’, risultano ancora in parte sconosciuti. Scopo dello studio qui proposto è stato quello di valutare, in vitro, su colture di cellule endoteliali microvascolari di derivazione umana (HMEC-1), gli effetti, a breve termine, derivanti dalla stimolazione con onde d’urto defocalizzate. MATERIALI E METODI Colture di cellule endoteliali microvascolari di derivazione umana HMEC - 1 sono state sottoposte a diversi regimi di stimolazione con uSW, mediante utilizzo di litotritore a sorgente elettroidraulica (Dermagold, MTS) (EFD 0.01 mJ/mmq; EFD 0.02 mJ/mmq; EFD 0.10 mJ/mmq, rispettivamente a 200 ed 800 colpi totali per ciascun livello di energia). HMEC – 1 è la prima linea immortalizzata di cellule endoteliali microvascolari di derivazione umana, in grado di mantenere in coltura le caratteristiche morfologiche, fenotipiche e funzionali delle cellule originarie normali. La vitalità cellulare post – trattamento è stata verificata mediante esame spettrofotometrico (XTT – assay) a 24 h.; per valutare inoltre il potenziale effetto angiogenetico, le cellule sono state poste in coltura su substrato Matrigel, e le strutture simil - microvascolari formatesi sono state poi quantificate, contando le connessioni capillari mediante osservazione al microscopio invertito. Quando infatti le cellule HMEC – 1 vengono poste in coltura su tale tipo di terreno (secondo un modello descritto in letteratura), possono formare una rete tridimensionale di strutture simil tubulari (o simil – capillari), comparabili alla cascata finale del processo angiogenetico in vivo. E’ stata anche valutata l’espressione genica a breve termine (3 h. dopo stimolazione uSW), mediante tecnica microarray . I dati sono stati elaborati statisticamente mediante test di Dunnet. RISULTATI I risultati più rilevanti sono stati ottenuti per stimolazione con le basse energie e più basso numero di colpi. I risultati dell’analisi spettrofotometrica a 24 h. hanno rilevato un aumento di attività metabolica nelle colture di cellule trattate vs. i controlli (rapporto di Densità Ottica 1.8). Relativamente ai tests di angiogenesi (a 24h), si è rilevata la formazione di strutture simil – capillari in quantità maggiore nelle colture sottoposte ad uSW, rispetto ai controlli (31.40 ± 2.064 vs 17.00 ± 3.286; p<0.05). Dal punto di vista dell’espressione genica, a breve termine (3 h. post – uSW), si è potuta osservare un’importante down–regulation dei geni preposti all’inibizione del ciclo cellulare, così come di quelli che regolerebbero l’apoptosi. DISCUSSIONE In letteratura, le prime descrizioni sugli effetti derivanti dall’applicazione della litotripsia su colture cellulari, riportarono di danni alle membrane ed altre strutture cellulari, ed in particolare delle cellule endoteliali stesse. E’ oggi ormai noto che tale effetto di tipo “litico” è in realtà da considerarsi dose – dipendente, così come si riconosce il valore “relativo” delle osservazioni in vitro, stante il grado di complessità strutturale ed integrata dei tessuti viventi, su cui le onde d’urto vengono applicate nella pratica clinica quotidiana. I risultati preliminari qui proposti evidenzierebbero un potenziale effetto di stimolo sull’attività metabolica, nonché un effetto mitogenico, indotto dalla stimolazione uSW su cellule endoteliali microvascolari umane; il tutto associato, dal punto di vista dell’espressione genica, alla soppressione dei geni che inibiscono il ciclo cellulare, così come di quelli pro – apoptotici. Il riscontro di un’aumentata attività metabolica ed angiogenetica, in vitro, dopo stimolazione uSW, se da un lato incoraggia ad utilizzare tale modello sperimentale per ulteriori studi in vitro, dall’altro suggerisce alcune interessanti speculazioni sui processi di angiogenesi e riparazione tissutale meccano – indotti (ruolo chiave dell’endotelio, nei meccanismi di riparazione tissutale in vivo, come bersaglio principale della stimolazione uSW).