Uso di sonde fluorescenti per lo studio dell'attività e della regolazione del sistema di trasporto K+/aminoacidi neutri in Bombyx mori

Il sistema di trasporto K+-dipendente per gli aminoacidi neutri, ampiamente studiato nelle larve di Bombyx mori L., è perfettamente adattato alle peculiari condizioni presenti nell’intestino medio larvale. Sebbene sia in grado di operare in assenza di K+, è notevolmente attivato dal gradiente di K+, dalla presenza di un potenziale elettrico transmembrana e da un pH esterno alcalino. Questo sistema di trasporto, che lega preferenzialmente leucina ma è responsabile anche dell’assorbimento della maggior parte degli aminoacidi essenziali, è sotto il controllo di diversi fattori. In particolare, abbiamo identificato una famiglia di molecole, di cui la più attiva è la leucina metilestere (LeuMe), in grado di aumentarne l’attività in vitro e di attivare per ingestione l’assorbimento degli aminoacidi in vivo, a conferma che questo processo influenza lo sviluppo dell’intero organismo. La conoscenza delle proprietà funzionali e dei processi regolativi dei sistemi di trasporto intestinale degli aminoacidi in B. mori è utile sia per comprenderne le esigenze nutrizionali durante lo sviluppo larvale, specialmente durante l’ultima età, caratterizzata dalla massiccia sintesi delle proteine della seta, che per la formulazione di adeguate diete artificiali. L’utilizzo di traccianti radioattivi ha rappresentato finora un efficace mezzo per lo studio dei meccanismi di trasporto transmembrana, ma questa tecnica comporta l’esposizione del ricercatore a rischio radiologico e la produzione di rifiuti la cui gestione è complessa e costosa. Poiché l’uptake K+-dipendente della leucina è associato al trasporto della carica netta positiva dello ione, abbiamo valutato se l’impiego del DisC3(5), una sonda fluorescente sensibile alle variazioni del potenziale elettrico di membrana, fosse una valida alternativa ai traccianti radioattivi per la misura del trasporto di aminoacidi e della sua regolazione, in vescicole di membrana di orletto a spazzola purificate dall’intestino medio larvale di B. mori. Dopo aver calibrato il segnale fluorescente, l’utilizzo di questa tecnica ha consentito di misurare l’uptake di diverse concentrazioni di leucina e di rilevare l’incremento del trasporto dovuto all’effetto della LeuMe. Questa tecnica ha permesso di evidenziare, per al prima volta, che l’attivatore è in grado di aumentare il trasporto anche della forma binaria K+-trasportatore, cioè in assenza di leucina. In conclusione la tecnica fluorimetrica, seppur meno sensibile dei traccianti radioattivi, risulta idonea per lo studio funzionale dei trasporti di membrana che comportano il movimento di cariche nette.