L’UNIONE EUROPEA APPROVA UN TEST IMPORTANTE NELLA DEFINIZIONE DEL DOSAGGIO DI FARMACI AD ELEVATA TOSSICITÀ UTILIZZATI NELLA CHEMIOTERAPIA ANTINEOPLASTICA.

Augusto Pessina,
Dipartimento di Sanità Pubblica, Microbiologia, Virologia ,Facoltà di Medicina e Chirurgia
 Università Statale di  Milano

La notizia
Il 21 marzo 2006 il comitato scientifico consultivo del Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (ECVAM) ha approvato  sei nuovi metodi di prova alternativi che consentiranno di ridurre il ricorso alla sperimentazione animale per alcuni farmaci e sostanze chimiche . I nuovi tests, effettuati su colture cellulari anziché su animali, permettono di determinare la tossicità dei farmaci antitumorali e identificare i farmaci contaminati. Oltre a ridurre il numero di animali necessari ai fini della sperimentazione, i metodi approvati oggi miglioreranno l’accuratezza dei test e contribuiranno così a rendere i prodotti più sicuri. 
Uno dei test approvati è noto come Colony Forming Unit-Granulocytes-Macrophages (CFU-GM) ed è volto a render più preciso il dosaggio di alcuni farmaci ad elevata tossicità utilizzati nella chemioterapia per la cura dei tumori.

Il gruppo di ricerca
Il lavoro di ottimizzazione , prevalidazione (1) e  validazione (2)  di questo test nella sua applicazione  nel campo della ematotossicologia è stato eseguito da un  gruppo di ricerca internazionale costituitosi  nel 1996 e coordinato dal Dr Augusto Pessina ( Responsabile del Laboratorio di Colture Cellulari della Sezione di Microbiologia del  Dipartimento di Sanità Pubblica, Microbiologia, Virologia della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’ Università Statale di  Milano ) . Il gruppo di ricercatori dell’Università di Milano , con il supporto del Consorzio Milano Ricerche  in collaborazione con ECVAM, JRC( Ispra), ha coordinando lo studio  coinvolgendo quattro centri di ricerca in : Spagna (Cell Biology, Environment Institute, CIEMAT, Madrid);  Francia (Ecole Superieure de Microbiologie et Sècurité Alimentaire (ESMISAB), Universitè de Bretagne Occidentale, Plouzanè ); Belgio ( Department of Environmental Toxicology, VITO-Flemish Institute for Technological Research, Mol ) e Stati Uniti ( Laboratory of Pharmacology, Cancer Centre, Wayne State University, Detroit (MI)). La fase di validazione del test è stata rigorosamente  eseguita in “doppio cieco” avvalendosi di agenti  esterni: BIBRA International, Carshalton (UK) ed Oncology Research and Regulatory Consulting Associates, Grosse Pointe Woods (USA) che hanno  fornito le molecole da studiare  codificate secondo criteri di GLP e sicurezza. 

Il test GM-CFU
Il test validato è un test clonogenico in coltura semisolida ( agar o  metilcellulosa) in cui la proliferazione/differenziazione di progenitori emopoietici è ottenuta per stimolazione “ in vitro” con specifiche citochine (3). Diversi protocolli sperimentali   sono stati suggeriti ed utilizzati  in ematologia ma  pochi di questi sono stati sviluppati fino ad ottenere uno  procedura operativa standardizzata atta a valutare la tossicità in vitro di molecole sul sistema emopoietico (4). Lo studio in questione ha riguardato il test clonogenico che prevede la stimolazione dei progenitori granulocitico-macrofagici (GM-CFU) del quale è stata  messa a punto una procedura standard  successivamente analizzata  per la sua riproducibilità in condizioni sperimentali diverse per  specie animale (murina verso umana ) , sorgente di progenitori ( midollo osseo  verso sangue di cordone ombelicale), attività stimolante e composizione del terreno colturale (citochina singola verso coktail  di citochine ) ecc. In questo modo è il test è stato adattato ed applicato a studi di ematotossicologia in vitro dove è richiesto che l’attività tossica del composto sia influenzata il meno possibile dalle condizioni colturali.  La validazione ha quindi prodotto un modello predittivo che permette di  aggiustare i dati di tossicità ottenuti nell’animale cosi da applicarli all’uomo con maggiore affidabilità e sicurezza.  

L'ematotossicità
Per comprendere adeguatamente la portata di questo test è necessario avere presente alcuni aspetti essenziali riguardanti l'ematotossicità.
Il rapido turnover delle cellule del sistema emopoietico (deputato a mantenere l’omeostasi di tutto il sangue compresa buona parte della componente immunitaria) lo rende un bersaglio molto sensibile  ai fenomeni di tossicità  che si esplicano con diversi meccanismi sia verso cellule mature , che  verso progenitori in rapida  proliferazione e differenziazione . Questi particolari effetti avversi sono conseguenza diretta della assunzione di farmaci  oppure secondari alla tossicità  espressa verso altri organi o sistemi. 
Se per certe terapie ed entro certi limiti  un tale effetto tossico è inevitabile per ottenere benefici , in altri casi è assolutamente intollerabile ed  è quindi importante disporre di strumenti adeguati per predire fenomeni  gravi di ematotossicità come certe forme di mielosoppressione o granulocitopenia .
Anche dopo l’avvento dei bersagli molecolari nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici , per oltre il 50 %  dei farmaci  antineoplastici la mielotossicità  è ancora una delle maggiori limitazioni  all’uso di dosaggi pieni.
Le agenzie regolatrici  richiedono,  per tutti i farmaci , studi di tossicologia in vivo  in almeno due specie animali (una delle quali non-roditore, di solito il cane) e la loro potenziale ematotossicità è  dedotta  dai parametri di ematologia clinica monitorati nell’animale (come la severità della citopenia, tempi di esposizione necessari, grado di reversibilità, ecc)  sulla base dei quali si tenta di  predire la tossicità nella specie umana.  Ancora oggi, i dati sperimentali costituiscono il principale criterio usato per calcolare  la più alta dose  da amministrare nella cosiddetta fase I di sperimentazione clinica  fatta nell’uomo e gli aspetti regolatori sottolineano l’importanza di stabilire due fondamentali  livelli di esposizione:  la più elevata dose che non causa effetti avversi e quella che causa la massima perturbazione tollerata nella conta del sangue periferico (definita come MTD)(5). Quasi il 30% dei farmaci fallisce durante i trials clinici su pazienti a causa degli effetti tossici, nonostante siano stati eseguiti preventivamente tutti i tests tossicologici in animale .
Proprio per prevedere se un nuovo  composto sarà clinicamente tossico sul midollo osseo  umano, i tests in vitro possono ridurre l’incertezza  insita nella estrapolazione  dall’animale di laboratorio alla  specie umana e contribuire ad una più precisa previsione.

Importanza predittiva del test GM-CFU 
Il test GM-CFU è stato  validato come strumento predittivo della neutropenia acuta in pazienti esposti a farmaci antitumorali. La procedura standard utilizza cellule da midollo osseo di topo e cellule da sangue di cordone ombelicale umano(che contiene cellule staminali e progenitori ematici che rispondono in modo simile a quelli del midollo osseo) sulle quali viene determinata la tossicità diretta dei composti. 
Rispetto alla sola sperimentazione animale , questo test offre un maggior grado di precisione, poichè affina i margini di sicurezza riducendo l’incertezza dovuta alla estrapolazione animale/uomo e fornisce una base più razionale per determinare  le dosi cliniche e valutare i limiti di esposizione umane  definiti come massima dose tollerata (MDT). In pratica quindi il test GM-CFU  contribuisce a ridurre il rischio di sovradosaggio letale che può verificarsi nel primo gruppo di pazienti trattati con nuovi farmaci.
Infatti, la prima fase della sperimentazione farmacologia clinica  ( cosiddetta di fase I  ) ha come obiettivo quello di valutare la MDT nell’uomo mediante somministrazione di quantità crescenti di farmaco  in volontari sani e maschi e nell’intraprendere  questa fase clinica è importante che meno pazienti possibile siano trattati con dosi di farmaco ad elevato rischio tossico. Va anche sottolineato che  per i nuovi tipi di farmaci ( proteine ricombinanti, anticorpi, ecc)  che rappresentano oltre il 50 % nelle nuove notifiche , la tossicologia tradizionale non funziona bene o non funziona affatto e questo test potrebbe offrire un ulteriore strumento di indagine tossicologica.  

Conclusione
I risultati già ottenuti con questo tests sono quindi  molto importanti per almeno due fondamentali aspetti: 
Uno, più diretto, che i tests in vitro come quello validato contribuiscono a migliorare il livello di sicurezza nei trials clinici di fase I.  Ciò è di  importanza critica soprattutto alla luce di quanto recentemente riportato nel marzo 2006  circa il drammatico esito che ha avuto il trattamento di alcuni giovani con  un nuovo farmaco (TGN1412) in sperimentazione a Londra 
L’altro, più generale, sottolinea che le tecniche di colture cellulari in vitro possono essere utili nel valutare  differenze di specie così che con diversi modelli cellulari (per esempio murino e  umano ) si possa tentare di estrapolare dati su possibili effetti “in vivo” nella specie umana. Poiché recenti pubblicazioni (6,7) hanno anche mostrato che la procedura standard validata può  essere miniaturizzato in piastre da 96 pozzetti essa può quindi essere applicata ad un elevato numero di molecole di grande interesse per l’industria farmaceutica proprio nelle prime fasi di sviluppo di una nuova molecola.
Infatti, il test nella sua versione miniaturizzata è stato recentemente applicato per valutare la sensibilità in vitro di precursori mieloidi umani e di topo verso dieci nuove molecole antitumorali della Cancer Research UK ed  ha confermato che le curve dose-risposta  predittive come nel test originale validato tanto da  suggerire che possa esser usato in high-throughput screening. 

Bibliografia
1 Pessina, A., Albella, B., Bueren, J., Brantom, P., Casati, S., Gribaldo, L., Croera, C., Gagliardi, G., Foti, P., Parchment, R., Parent-Massin, D., Sibiril, Y., Schoeters, G. and Van Den Heuvel, R (2001) Prevalidation of a model for predicting acute neutropenia by Colony Forming Unit-Granulocyte/Macrophage (CFU-GM) assay. Toxicology in Vitro 15, 729-740.
2 Pessina A, Albella B, Bayo M, Bueren J, Brantom P, Casati S, Croera C, Gagliardi G, Foti P, Parchment R, Parent-Massin D, Schoeters G, Sibiril Y, Van Den Heuvel R, Gribaldo L. (2003) Application of the CFU-GM assay to predict acute drug-induced neutropenia: an international blind trial to validate a prediction model for the maximum tolerated dose (MTD) of myelosuppressive xenobiotics. Toxicological Sciences 75, 355-367.
3 Bradley TR, Metcalf D. (1966) The growth of mouse bone marrow cells in vitro. Austr J Exp Biol Med  44, 287-298. 
4 Pessina A, Malerba I, Gribaldo L.(2005) Haematotoxicity testing by cell clonogenic assay in drug development and preclinical trials. Curr.Pharmaceut.Design 11,1055-1065.
5 Parchment RE, Huang M, Erickson-Miller CL.(1993) Roles for “In vitro” Myelotoxicity Tests in Preclinical Drug Development and Clinical Trial Planning. Toxicologic Pathology  21, 241-250. 
6 Pessina A, Croera C, Bayo M,  Malerba I, Passardi L, Cavicchini L,Neri MG, Gribaldo L.(2004) A methylcellulose microculture assay for the in vitro assessment  of drug toxicity on granulocyte- macrophage progenitors (CFU-GM). ATLA 32,7-23.
7 Malerba I, Ferrario D,Farmer H,Gribaldo L,Casati S. (2006). Inhibition of GM-CFU colony growth by ten anticancer drugs assessed by a high-throughput clonogenic microtest. Comm. To 46th ETCS Meeting , March 26-29, Verona, Italy.