EXPLORATION OF THE CHEMICAL SPACE: DIVERSITY-ORIENTED AND CHEMOENZYMATIC APPROACHES

This dissertation is an overview of a three-years project, aimed at the exploration of new regions of the chemical space, that could contain new unusual bioactive compounds. The already discovered small molecules cover only a small portion of the chemical universe, that becomes even narrower when bioactive compounds are considered. In this context, two different strategies for the investigation of the chemical space have been considered: the diversity oriented-synthesis (DOS), that constitute the major topic of the work, and a chemoenzymatic approach, developed during a period spent at the University of Warwick (UK), in the laboratory of Professor M. Tosin. Chapter 1 deals with the general principles of the DOS approach, focusing then the attention on a library of piperidine-based compounds previously synthesised in Professor Passarella’s research group, starting from a common precursor, 2-piperidine ethanol (1). An overview of the main results previously accessed in this field is reported. At the end of the chapter, the planning of a further expansion of this library is presented. The structure of the newly accessed piperidine-based products is appreciable in Figure 1 (see Figure 1 in the abstarct version reported in the thesis file); their obtainment was the main goal of this thesis. Chapter 2 is focused on the stereoselective synthesis of eight highly diversified polyheterocyclic compounds, characterized by three different scaffolds. In particular, the different scaffolds were originated by the same precursor, considering that its different syn- or anti- stereocenter configuration, influenced the reaction outcome. This project opens the possibility of accessing analogs of some natural products, such as lupin and lycopodium alkaloids. Chapter 3 concerned the obtainment of a library of potential Hedgehog (Hh) signalling pathway inhibitors, rationally designed exploiting docking simulations and taking inspiration from a class of natural products, the withanolides. The designed scaffold contains two key motif, a bicyclic carbamate and an α,β-unsaturated lactone, and presents three stereocenters. So far, two out of the four racemic isomers have been accessed and biological evaluation revealed two interesting intermediates, that have been synthesised also as separate enantiomers. Moreover, preliminary studies toward the obtainment of 2nd generation inhibitors have been performed in our laboratory. Biological evaluation of these compounds is currently in progress and will orient the future development of this work. Chapter 4 is aimed at the synthesis of (-)-anaferine as an unexpected further ramification of our DOS approach. Key intermediate 10, already exploited for the synthesis of the inhibitors of chapter 3, has been employed as starting material, converting its homoallylic alcohol into an α,β-unsaturated lactam. To this extent, the same approach used in chapter 1, to transform 9 into a similar lactam (left compound in the pink box of Figure 1) was applied. After that, the synthesis of (-)-anaferine was accomplished in few steps, reducing the lactam to piperidine and oxidizing the 2-hydoxypropane bridge to the corresponding ketone. Chapter 5 deals with the synthesis of thiocolchicine-based bivalent compounds, possibly acting as microtubules binders. A hybrid compound, bearing the key structural features of pironetin (one of the few known α-tubulin binder), previously synthesised on our laboratory from 2-piperidine ethanol, was exploited as key building block. In fact, it was connected through different linkers to N-10-deacteyl-thiocolchicine, a model of β-tubulin binder. Biological tests revealed that the lipophilic nature of the linkers rendered our conjugates better substrates for P-glycoprotein, leading to a drop in activity on resistant cancer cells. Therefore, new bivalent compounds will be soon produced in our laboratory, changing linkers chemo-physical properties. Structures of the new compounds resulting from the expansion of the DOS-approach from 2-piperidine ethanol 1. Finally, chapter 6 concerned a project aimed at the generation of unnatural, diversified derivatives of lasalocid A and salinomycin, through feeding experiments of malonate-mimicking chemical probes to the natural Streptomyces producers, in an approach resembling mutasynthesis. The efforts were focused on the devopment of different strategies for an easier recovery and analysis of the unnatural products from the complex mixtures of the fermentation broths. To this extent, four chemical probes have been synthesised and proof on concept experiments were performed to verify their applicability in this field.

La seguente dissertazione è un riassunto di un progetto di dottorato della durata di tre anni, condotto con lo scopo di esplorare nuove regioni dello spazio chimico, che potrebbero contenere interessanti molecole bioattive. Infatti, al giorno d’oggi, solo una porzione molto limitata dello spazio chimico è stata investigata. Oltretutto, tale porzione diventa ancora più ristretta se si considerano solo molecole caratterizzate da attività biologica. In questa tesi sono state considerate due diverse strategie per consentire un’ulteriore esplorazione dello spazio chimico: si tratta della diversity-oriented synthesis (DOS) e di un particolare approccio chemoenzimatico, sviluppato durante sei mesi trascorsi presso l’Università di Warwick (UK), sotto la supervisione della Professoressa Manuela Tosin. Capitolo 1. Il primo capitolo della tesi contiene un’introduzione generale ai principi della diversity-oriented synthesis, che costituirà il tema principale della dissertazione. Successivamente viene presentata una overview dettagliata, riguardante un approccio DOS sviluppato negli ultimi anni nel gruppo Passarella. Tale approccio si basa sull’utilizzo del 2-piperidinetanolo (1) come precursore per ottenere una libreria di derivati piperidinici diversificati. Alla fine del capitolo, viene presentata la progettazione di un’ulteriore espansione di tale libreria, tramite la sintesi dei prodotti riportati in Figura 1 (La figura può essere visionata nella versione dell'abstract riportata nel file della tesi). Capitolo 2. Questo capitolo riguarda la sintesi enantioselettiva di otto prodotti polieterociclici, caratterizzati da tre scaffolds altamente diversificati. La diversificazione strutturale è stata ottenuta a partire da un intermedio comune, sfruttando la diversa reattività dei suoi diastereoisomeri syn e anti, che, posti nelle medesime condizioni di reazione, hanno portato a prodotti strutturalmente diversi. In tal modo, analoghi di alcaloidi naturali sono stati ottenuti. Capitolo 3. In questo capitolo viene presentata la sintesi di una libreria di potenziali inibitori dell’hedgehog signalling pathway. La struttura degli inibitori è stata disegnata sulla base di studi di docking, prendendo ispirazione da una classe di prodotti naturali, i withanolidi. Gli elementi chiave del design sviluppato sono un carbammato biciclico, ottenibile da 1, e un lattone α,β-insaturo. La struttura presenta tre stereocentri e, ad oggi, due su quattro stereoisomeri racemi sono stati sintetizzati. I test biologici hanno rivelato due intermedi attivi, che sono stati sintetizzati anche in versione enantiopura. Inoltre, studi preliminari, volti allo sviluppo di inibitori di seconda generazione, sono attualmente in corso. Capitolo 4. In questo capitolo viene presentata la sinesi di un prodotto naturale, la (-)-anaferina, ottenuta come ulteriore ramificazione del nostro approccio DOS. L’idea è nata prendendo ispirazione dall’intermedio 10, già usato per la sintesi degli inibitori hedgehog. Infatti, il suo alcol omoallilico può essere convertito in un lattame α,β-insaturo (usando una procedura analoga a quella impiegata per la sintesi del primo prodotto presente nel riquadro rosa in Figura 1). Una volta ottenuto il lattame, questo può essere ridotto a piperidina. La successiva ossidazione del ponte 2-idrossipropanico a chetone permette poi di completare la sintesi della (-)-anaferina. Il Capitolo 5 riporta la sintesi di coniugati bivalenti, potenzialmente in grado di interagire con le tubuline in modo sinergico. Gli elementi chiave di tali coniugati sono un composto ibrido, precedentemente sintetizzato nel gruppo Passarella a partire da 1, e la N-10-deacetiltiocolchicina, noto legante di β-tubulina. Il prodotto ibrido contiene invece i motivi fondamentali della struttura della pironetina, noto legante di α –tubulina. Le due funzionalità attive sono state connesse da linkers diversi. Tuttavia i test biologici hanno evidenziato come la scelta di impiegare linkers lipofilici abbia reso i nostri coniugati migliori substrati per la P-glicoproteina, coinvolta nello sviluppo della resistenza ai farmaci, sviluppata da diverse cellule tumorali. Per questo motivo, nuovi coniugati verranno presto prodotti nel nostro laboratorio, testando linkers diversi. Infine, il Capitolo 6 ha riguardato la generazione di versioni non naturali e diversificate di due antibiotici, lasaloside A e salinomicina. A tal fine, un approccio simile alla mutasintesi, basato sulla somministrazione di probes chimiche, mimiche del malonato, ai microrganismi produttori di tali antibiotici, è stato impiegato. In particolare, diverse strategie, per un facile recupero e analisi dei prodotti non naturali presenti nei complessi brodi di fermentazione, sono state considerate. Quattro probes sono state sintetizzate e diversi esperimenti sono stati sviluppati per verificare la loro applicabilità in tale contesto.