THE RELEVANCE OF LONG NON-CODING RNA IN THE BIOLOGICAL AND CLINICAL HETEROGENEITY OF MULTIPLE MYELOMA

Multiple myeloma (MM) is a malignant proliferation of antibody-secreting bone marrow plasma cells that accounts for 10% of all hematological malignancies. MM is characterized by a wide clinical spectrum ranging from the presumed pre-malignant condition called monoclonal gammopathy of undetermined significance, to extra-medullary myeloma/plasma cell leukemia (PCL). Despite the remarkable improvements in treatment and patient care, MM remains an incurable disease. In the last few years it has been demonstrated that the vast majority (>90 %) of the human genome sequence is actively transcribed, but only less than 2% of transcripts serve as mRNA to encode protein. The non-coding RNAs (ncRNAs) are involved in various biological processes and are commonly divided into short (<200nt), including microRNAs (miRNAs), and long (>200 nt, lncRNAs) transcripts. The dysregulation of ncRNAs has been reported to occur virtually in all types of cancer including MM. The role of miRNA in malignant transformation has been widely explored and recently different lncRNA roles has been the identified in normal and malignant cells. With the aim to identify lncRNAs modulated in MM, we set up the condition to the use of GeneChip® Human Gene 2.0 ST microarray, able to distinguish more than 10000 lncRNAs, and RNAseq methods. Based on these analyses, on our cohort of MM patients (50 MM primary tumors, 15 PCL and 4 normal donors), we evidenced ST3GAL6-AS1 as the unique lncRNA up-modulated in pathological samples compared to normal controls. GEP data evidenced the up-modulation of this lncRNA and a significant correlation with ST3GAL6, neighboring gene of ST3GAL6-AS1, expression levels. ST3GAL6 codes for a protein able to produce proteins and lipids glycosylation, and a role for ST3GAL6 in homing and engraftment of MM has been described. In our study, ST3GAL6-AS1 and ST3GAL6 were overexpressed in human MM cell lines (HMCLs), and showed equally localization in nuclear and cytoplasmic fractions and a long half-life. Molecular analysis of ST3GAL6-AS1 in HMCLs showed the presence of the splice single nuclear polymorphic (SNP) variation rs13065271 with the production of unpredicted splice events (retention of intron 3 and skipping of exon 3). In particular, homozygous minor allele HMCLs showed a nuclear localization of the lncRNA, a low expression and half-life of transcripts shorter than the HMCLs with at least one major allele. Furthermore, the SNP rs13065271 analysis made on MM patients confirmed the significant down-regulation of ST3GAL6-AS1 expression levels in homozygous minor allele patients. Additionally, silencing of ST3GAL6-AS1 in HMCLs by GapmeR approach evidenced a significant down-regulation of the lncRNA in all the HMCLs investigated. SNP homozygous minor allele HMCLs did not evidenced biological effects; by contrast, HMCLs with at least one SNP major allele evidenced biological effects in terms of decrease of cell growth and viability, changes in percentage of cell cycle phases, increase of percentage of apoptotic cells, and loss of capability to form colonies. GeneChip® Human Gene 2.0 ST microarray analysis on silenced HMCLs evidenced the up-regulation of FUCA1, coding for a lysosomal enzyme involved in the degradation of fucose-containing glycoproteins and glycolipids. Additionally, the expression levels of FUCA1 in our cohort of patients resulted significantly inversely correlated with ST3GAL6-AS1 expression levels. Overall, these data suggest the hypothesis that ST3GAL6-AS1 may act on the down-regulation of FUCA1 in MM.

Il mieloma multiplo (MM) è una proliferazione maligna di plasmacellule del midollo osseo secernenti anticorpi, che rappresenta il 10% di tutte le neoplasie ematologiche. Il MM è caratterizzato da un ampio spettro clinico che va da una presunta condizione pre-maligna chiamata gammopatia monoclonale di significato indeterminato a mieloma extra-midollare/ leucemia plasmacellulare (PCL). Nonostante i notevoli miglioramenti nel trattamento e nella cura dei pazienti, il MM è ancora una patologia incurabile. Negli ultimi anni è stato dimostrato che la stragrande maggioranza (> 90%) della sequenza del genoma umano viene attivamente trascritta, ma solo meno del 2% dei trascritti è rappresentato da RNA messaggero e codifica per proteine. Gli RNA non codificanti (ncRNA) sono coinvolti in vari processi biologici e sono comunemente suddivisi in RNA non codificanti corti (<200nt), come i microRNA (miRNA), e lunghi (> 200 nt, lncRNA). La de-regolazione dei ncRNA è stata evidenziata in tutti i tipi di tumore, compreso il MM. In particolar modo il ruolo dei miRNA nella trasformazione maligna è stato ampiamente esplorato e solo di recente sono stati evidenziati diversi ruoli dei lncRNA sia nelle cellule normali che patologiche. Con l'obiettivo di identificare i lncRNA modulati nel MM, abbiamo messo a punto le condizioni per l'utilizzo del GeneChip® Human Gene 2.0 ST microarray, in grado di distinguere più di 10000 lncRNA, e la metodica dell’RNAseq. Sulla base di queste analisi, effettuate sulla nostra casistica di pazienti (50 tumori primari di MM, 15 PCL e 4 donatori sani), abbiamo evidenziato ST3GAL6-AS1 come unico lncRNA che presenta un significativo incremento di espressione nei campioni patologici rispetto ai controlli sani. I dati GEP hanno evidenziato l’incremento di espressione di questo lncRNA e una correlazione significativa con i livelli di espressione di ST3GAL6, gene adiacente a ST3GAL6-AS1. ST3GAL6 codifica per una proteina che agisce nel processo di produzione di proteine e lipidi glicosilati, ed è stato descritto un suo ruolo nel MM come attore nello spostamento delle cellule (fenomeno dell’“homing”) e nel loro attecchimento nel midollo osseo. Nel nostro studio, ST3GAL6-AS1 e ST3GAL6 hanno mostrato una sovra espressione nelle linee cellulari umane di MM (HMCLs), una localizzazione omogenea nelle frazioni nucleari e citoplasmatiche e una lunga emivita. L'analisi molecolare di ST3GAL6-AS1 nelle HMCLs ha evidenziato la presenza di un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) con codice rs13065271 che interessa un nucleotide fondamentale per gli eventi di splicing. Infatti, la presenza di questo SNP produce 2 eventi di splicing non predetti: la ritenzione dell'introne 3 e il salto dell'esone 3. In particolare, le analisi molecolari su HMCLs omozigoti per l’allele minore hanno mostrato una localizzazione nucleare del lncRNA, un'espressione bassa e un'emivita dei trascritti più breve rispetto alle HMCLs che presentano almeno un allele maggiore. Inoltre, l'analisi dello SNP rs13065271, effettuata su pazienti affetti da MM, ha confermato una significativa riduzione dell’espressione di ST3GAL6-AS1 in pazienti omozigoti per l’allele mutato. Il silenziamento di ST3GAL6-AS1 in HMCLs mediante l’utilizzo di GapmeR ha messo in luce una significativa diminuzione del lncRNA in tutte le HMCLs esaminate. Le HMCLs in omozigosi per l’allele minore dello SNP non hanno presentato effetti biologici; al contrario, le HMCLs con almeno un allele maggiore dello SNP hanno evidenziato effetti biologici in termini di diminuzione della crescita e vitalità cellulare, variazioni della percentuale delle cellule nelle fasi del ciclo cellulare, aumento della percentuale delle cellule apoptotiche e perdita della capacità di formare colonie. L'analisi di microarray con GeneChip® Human Gene 2.0 ST sulle HMCLs silenziate ha rivelato un aumento dell’espressione di FUCA1, gene codificante per un enzima lisosomiale coinvolto nella degradazione delle glicoproteine e dei glicolipidi contenenti fucosio. Inoltre, i livelli di espressione di FUCA1 nella nostra casistica di pazienti di MM sono risultati inversamente correlati, in maniera significativa, con i livelli di espressione di ST3GAL6-AS1. Nel complesso, questi dati suggeriscono l'ipotesi che ST3GAL6-AS1 possa agire sulla regolazione negativa di FUCA1 nel MM.