DISSECTING ERAP2 ROLE IN HIV-1 INFECTION

Background: Immune response during HIV-1 infection and replication is quite complex because many viral and host factors, beyond individual variables, are involved at different levels. Many efforts have been made to evaluate the influence of these factors on HIV-1 infection and disease progression mainly focusing on the identification of genetic variants that can play a role in HIV-1 infection susceptibility. These studies have led to the concept of "immunological advantage". Moreover, the immunological advantage characterizing natural resistance to HIV-1 in HESN (HIV-exposed seronegative) has been associated with a number of polymorphisms (SNPs) in immune genes (e.g. ERAP2, APOBEC3H, MX2 and TLR3). However, the role of these SNPs in response to combination antiretroviral therapy (cART) has never been investigated. Among “protective” genes mentioned above, Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 2 (ERAP2) is involved in antigen presentation, trimming the amino-terminus of peptide precursors to the correct size for binding to HLA class I molecules. Haplotype-specific alternative splicing of the ERAP2 gene results in either a spliced (Hap B) or full-length (Hap A) mRNA. Interestingly, the frequency of the latter is higher in HESNs individuals and Hap A results correlated to in vitro HIV-1 infection natural resistance. Finally, the possibility of an alternative ERAP2 cellular localization has been recently investigated. The project aims to: 1) deepen the correlation between ERAP2 haplotypes and in vitro HIV-1 susceptibility; 2) investigate the role played by ERAP2 genetic variants and progression of HIV-1 infection in cART treated patients; and 3) examine the molecular mechanism by which Hap A and Hap B control peptide production for antigen presentation and the resulting CD8 mediated immune response. Methodology: To investigate the role of “protective” SNPs in response to cART, 300 HIV-1-infected patients from the Italian ICONA cohort undergoing a first HAART regimen were enrolled and genotyped for the “resistance” variants in ERAP2, TLR3, APOBEC3H and MX2 genes. Periodically (basal, 6 months and 1 year post cART initiation) HIV-infected patients’ clinical parameters (gender, CD4/CD8 cell count, viral load, therapies, year of infection, clinical evolution) were collected and analysed for possible correlation with the above mentioned genetic variants. In parallel, to investigate the role of ERAP2 in in vitro HIV-1 susceptibility, PBMCs isolated from 30 healthy control (HC), grouped according to their ERAP2 genotype, were infected with HIV-1Ba-L in presence/absence of recombinant (rh) ERAP2 (100ng/mL) or with/without DG013A (100 nM/mL), an ERAP2 inhibitor, and analysed for: 1) susceptibility to HIV-1 infection (p24 ELISA assay); 2) expression mRNA levels of genes involved in the antigen presentation pathway; 3) MHC class I expression in cells and cytotoxic response by perforin/granzyme expression on CD8+ T cells. In addition, the trimming ability and modulation of CD8+ T cell response of Hap A and Hap B ERAP2 were assessed following transfection of DNA model constructs into ERAP2 deficient cells expressing a peptide precursor and evaluating by CPRG assay and B3Z response. Findings: Results obtained from HIV-1-infected patients undergoing cART therapy did not show any significant correlations between the genotypes of TLR3, APOBEC3G and MX2 (single or combined) and the progression of HIV-1 infection. The only exception was represented by ERAP2 gene, where HIV-infected Caucasian patients with a GG homozygosis condition for rs2549782 SNP (Hap A) showed a significant reduction (p=0.042) in viral load and a recovery in CD4+ T cells compared to heterozygous or homozygous TT patients (Hap B). Data obtained in Hap A HC showed a less susceptibility to in vitro HIV-1 infection compared to Hap B. Inhibition of ERAP2 activity by DG013A peptide increased HIV-1 infection in all PBMCs independently from their haplotypes. The role of ERAP2 in antigen processing in HIV-1 susceptibility has been confirmed by increased mRNA expression of other aminopeptidases and transporter, such as ERAP1 and TAP1 (P<0.05; P<0.01;P<0.005), in a condition where ERAP2 was inhibited. In line with these findings, transfection experiments showed that models for Hap A ERAP2 trimmed the peptide precursor efficiently, whereas Hap B ERAP2 constructs showed a reduction in trimming activity which resulted in a decreased CD8+ T cell response (P<0.05, P<0.005, P<0.001). Addition of rhERAP2 to in vitro HIV-infected cells coupled with a reduction of viral replication in both ERAP2 haplotypes (p<0.01), without affecting cell viability. This protective effect was independent from an increase of HLA-ABC expression and/or of perforin and granzymes expression by CD8+ T lymphocytes. Conclusions: Haplotype A of ERAP2 is associated with a reduced in vitro HIV-1 susceptibility as well as slower disease progression in cART treated HIV-1 infected patients. The effect may be explained by a greater control of antigen presentation pathway in Hap A subjects, in terms of trimming activity and consequently modulation of CD8+ T cell immune response. The role of ERAP2 in the extracellular milieu is still undisclosed and needs further investigation. However, data herein suggest a defensive feature mediated through an unconventional mechanism, distinct from immune system modulation.

Introduzione: La risposta immunitaria contro HIV è composita e complessa: entrano in gioco molti fattori appartenenti sia al virus che all’ospite e le variabili interindividuali non sono trascurabili e agiscono su vari livelli. Molti studi sono stati condotti per valutare l’influenza che questi diversi fattori possono esercitare sull’infezione da HIV-1 e sulla progressione della malattia e particolare interesse è stato rivolto all’identificazione di fattori genetici in grado di modulare la suscettibilità all’infezione da HIV. Questo orientamento ha portato alla elaborazione del concetto di “vantaggio immunologico” che sembra contraddistinguere la naturale resistenza ad HIV riscontrata in individui HIV-esposti sieronegativi (HESN). In particolare, in questi soggetti tale resistenza è stata correlata a diversi polimorfismi genetici (SNPs) in geni che esercitano un ruolo nell’organizzazione e funzionamento del sistema immunitario (es. ERAP2, APOBEC3H, MX2 e TLR3). Tuttavia, l’eventuale coinvolgimento di questi SNP in pazienti sieropositivi sottoposti ad una terapia antiretrovirale combinata (cART) non è mai stato investigato. Tra i geni “protettivi” menzionati sopra, Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 2 (ERAP2) è un enzima coinvolto nel processo di presentazione antigenica, infatti, taglia le estremità amino terminali di precursori peptidici adattandoli alla corretta lunghezza per il legame con la tasca delle molecole HLA di classe I. Splicing alternativi aplotipo-specifici sul gene di ERAP2 originano sia un trascritto alternativo (Hap B) sia un trascritto definito full-lenght (Hap A). E’ Interessante osservare che la frequenza di quest’ultimo risulta maggiore in individui HESN e, inoltre, la presenza dell’aplotipo A è stata correlata alla naturale resistenza all’ infezione da HIV in vitro. Infine, recentemente, è stata discussa la possibilità dell’esistenza di una localizzazione di ERAP2 alternativa da quella consueta a livello del reticolo endoplasmatico. Alla luce di queste osservazioni il progetto di ricerca si propone di: 1) approfondire la correlazione tra aplotipi di ERAP2 e la suscettibilità in vitro al virus dell’HIV-1; 2) investigare il ruolo di varianti genetiche associate ad ERAP2 in rapporto alla progressione dell’infezione virale in pazienti sieropositivi riceventi terapia cART; ed 3) esaminare il meccanismo molecolare attraverso il quale Hap A e Hap B mediano la produzione di peptidi destinati alla presentazione antigenica e, di conseguenza, la risultante risposta immunitaria mediata da linfociti T CD8+. Metodi: Per investigare il ruolo svolto da SNP definiti “protettivi” in risposta alla cART sono stati arruolati 300 pazienti provenienti dalla corte italiana ICONA, riceventi per la prima volta la terapia HAART, sui quali sono state condotte analisi per genotipizzare le varianti resistenti sui geni codificanti ERAP2, TLR3, APOBEC3H e MX2. Periodicamente (basale, 6 mesi ed 1 anno dall’inizio della terapia cART) sono stati raccolti i parametri clinici dei pazienti (genere, conta cellulare CD4/CD8, carica virale (VL), terapia, anno di infezione, evoluzione clinica) e, successivamente, analizzati per identificare una possibile correlazione con le varianti genetiche citate in precedenza. In parallelo, per approfondire il ruolo rivestito da ERAP2 nella suscettibilità in vitro a HIV-1, PBMCs, isolate da 30 donatori sani (HC) suddivisi in funzione del loro genotipo per ERAP2, sono state infettate in vitro con HIV-1Ba-L in presenza/assenza di ERAP2 ricombinante (rh) (100ng/mL) o in presenza/assenza di DG013A (100 nM/mL), un inibitore di ERAP2. In seguito le culture cellulari sono state analizzate per valutare: 1) la suscettibilità all’ infezione da HIV-1 (saggio ELISA); 2) l’espressione dei livelli dei trascritti (mRNA) di geni coinvolti nei meccanismi di presentazione antigenica; 3) l’espressione di molecole MHC di classe I e la valutazione della risposta citotossica attraverso misurazione dei livelli di perforina/granzimi su cellule CD8+. Inoltre, l’abilità di taglio e la modulazione della risposta cellulare CD8-mediata di Hap A e Hap B è stata valutata attraverso saggi di trasfezione con costrutti modello su cellule ERAP2 deficienti, esprimenti precursori peptidici e valutati attraverso saggio CPRG e risposta B3Z. Risultati: I risultati ottenuti da pazienti HIV-1 infetti sottoposti a terapia cART non hanno mostrato nessuna correlazione significativa tra i genotipi di TLR3, APOBEC3G and MX2 (singoli o combinati) e la progressione dell’infezione da HIV-1. L’unica eccezione è rappresentata dal gene ERAP2, dove pazienti HIV-1 infetti di origine caucasica con condizione di omozigosi GG per rs2549782 SNP (Hap A) hanno mostrato una significativa riduzione (p=0.042) in carica virale e ripristino dei valori cellulari di linfociti CD4+, comparati ai pazienti eterozigoti o TT omozigoti (Hap B). I dati ottenuti da Hap A HC hanno mostrato una minor suscettibilità ad un’infezione in vitro rispetto a Hap B. L’inibizione dell’attività di ERAP2, ad opera del peptide DG013A, ha portato ad un aumento dell’infezione da HIV-1 in tutte le PBMCs, indipendentemente dal relativo aplotipo. Il ruolo mediato da ERAP2 nel processamento antigenico correlato alla suscettibilità verso HIV-1 è stato confermato da un aumento dell’espressione di trascritti (mRNA) di altre aminopeptidasi e trasportatori specifici, come ad esempio ERAP1 e TAP1 (P<0.05; P<0.01;P<0.005), in condizioni nelle quali ERAP2 era inibito. In linea con questi dati, esperimenti di trasfezione hanno mostrato che i modelli per ERAP2 Hap A presentano un’attività di processamento peptidico più efficiente, mentre costrutti modello per ERAP2 Hap B hanno mostrato una ridotta attività di taglio risultante in una diminuzione della risposta cellulare CD8-mediata (P<0.05, P<0.005, P<0.001). L’aggiunta in vitro di rhERAP2 in cellule infettate con HIV ha portato ad una riduzione della replicazione virale in entrambi gli aplotipi di ERAP2 (p<0.01), senza influenzare però la vitalità cellulare. Questo effetto protettivo è stato raggiunto indipendente dall’aumento dell’espressione di molecole HLA-ABC e/o innalzamento dei livelli di perforina e granzimi sui linfociti CD8+. Conclusioni: L’aplotipo A di ERAP2 è associato sia ad una riduzione della suscettibilità a HIV-1 in vitro sia ad una progressione più lenta della malattia in pazienti HIV-1 infetti sottoposti a trattamento cART. L’effetto può essere giustificato da un miglior controllo del meccanismo di presentazione antigenica in soggetti Hap A, definita in termini di attività di processamento peptidico e conseguente modulazione della risposta immune T CD8 mediata. Il ruolo extracellulare di ERAP2 è ancora in discussione e richiede ulteriori indagini. Nonostante ciò, i dati ottenuti suggeriscono un ruolo protettivo mediato da ERAP2 nell’infezione da HIV-1, probabilmente esercitato attraverso meccanismi non convenzionali, indipendenti dalla modulazione del sistema immunitario.