GENETIC LCAT DEFICIENCY AND ATHEROSCLEROSIS: STUDIES ON ENDOTHELIAL CELLS AND MONOCYTES

Background Lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT) is the unique enzyme in human able to esterify free cholesterol in plasma. Genetic lack of LCAT affects high-density lipoprotein (HDL) metabolism, leading to very low plasma concentrations of these lipoproteins. LCAT was believed to be an important driving force behind macrophage reverse cholesterol transport (RCT) and therefore playing a role in atheroprotection. Despite the low plasma HDL-C, LCAT deficiency does not remarkably increase preclinical atherosclerosis or could even be protective. We hypothesized that this discrepancy can be explained by an increased functionality of HDL particles, that are more effective in protecting against endothelium dysfunction. Methods HDLs were isolated from LCAT-deficient carriers and tested in vitro for their capacity to promote NO production and to inhibit vascular cell adhesion molecules in endothelial cells. Measurement of flow-mediated vasodilation (FMD) was used as marker of endothelial dysfunction in vivo. Reconstituted HDL containing only apoA-I (LpA-I) or apoA-I and apoA-II (LpA-I:A-II) were used to prove the structural responsible for increased HDL functionality. Ex vivo analysis of monocytes in carriers of LCAT deficiency, to assessed phenotype and function, was performed with fluorescence-activated cell sorter analysis, inflammatory stimulation and transendothelial migration assays. Comparison with other genetic hypoalphalipoproteinemia was conducted for the monocyte study. Results Genetic LCAT deficiency is characterized by selective depletion of LpA-I:A-II and high presence of immature preβ-HDL. HDLs isolated from carriers were more effective in promoting in vitro eNOS activation by phosphorylation and consequently NO production in endothelial cells, compared to controls, with a gene-dose dependent effect. Moreover, HDLs from carriers have an increased capability in inhibiting VCAM-1 expression. The effect was likely dependent on the selective depletion in LpA-I:A-II particles. In addition carriers’ monocyte displayed a less inflammatory phenotype compared to controls, as evidenced by a reduced expression of integrin CD11c, a decreased capacity to transmigrate and a lower production of cytokines upon stimulation. Conversely, no changes in monocyte immunophenotype was found in other genetic HDL deficiency. As in vivo confirmation, no difference in FMD was found between carriers of LCAT deficiency and controls. Conclusions Despite the low plasma HDL-C concentration, LCAT deficiency is not associated with increased endothelial dysfunction due to the enhance efficacy of HDL particles in stimulating endothelial NO production and in inhibiting adhesion molecules expression, as well to the reduce pro-inflammatory potential of carriers’ monocytes.

Introduzione La lecitin:cholesterol aciltransferasi (LCAT) è l’unico enzima nell’uomo in grado di esterificare il colesterolo nel plasma. Il deficit genetico di LCAT influenza il metabolismo delle lipoproteine ad alta densità (HDL), portando a concentrazioni plasmatiche ridotte di queste lipoproteine. Si ritiene che LCAT sia un’importante driving force per il trasporto inverso del colesterolo (RCT) nei macrofagi e che pertanto giochi un ruolo importante nell’ateroprotezione. Nonostante i bassi livelli plasmatici di HDL-C, il grado di aterosclerosi preclinica non è risulta aumentato nel deficit di LCAT che addirittura sembra essere protettivo. Abbiamo quindi ipotizzato che questa discrepanza potesse essere spiegata da un aumento della funzionalità delle particelle HDL che sono più efficienti nel proteggere contro la disfunzione endoteliale. Metodi Le HDL sono state isolate da soggetti portatori di deficit di LCAT e testate in vitro per la loro capacità di stimolare la produzione di NO e di inibire l’espressione di molecole di adesione in cellule endoteliali. La misura della vasodilatazione flusso-mediata (FMD) è stata utilizzata come indice in vivo di disfunzione endoteliale. HDL ricostituite, contenenti solo apoA-I (LpA-I) o apoA-I e apoA-II (LpA-I:A-II) sono state utilizzate per dimostrare come quali modifiche strutturali siano responsabili dell’aumentata funzionalità. Analisi ex vivo del fenotipo e della funzionalità di monociti isolati da portatori di deficit di LCAT sono stati condotti tramite citometria a flusso, stimolazione e saggi di transmigrazione endoteliale. Portatori di altri deficit genetici di HDL sono stati utilizzati come confronto. Risultati Il deficit di LCAT genetico è caratterizzato da una deplezione selettiva di LpA-I: A-II e da alte concentrazioni di preβ-HDL immature. Le HDL isolate dai portatori si sono dimostrate più efficaci nel promuovere l'attivazione di eNOS in vitro mediante fosforilazione e, di conseguenza, la produzione di NO nelle cellule endoteliali, rispetto ai controlli, con un effetto gene-dose. Inoltre, le HDL dei portatori hanno una maggiore capacità di inibire l'espressione di VCAM-1. L'effetto è probabilmente dipendente dalla deplezione selettiva in lipoproteine LpA-I:A-II. Inoltre, i monociti dei portatori presentavano un fenotipo meno infiammatorio rispetto ai controlli, come evidenziato dalla ridotta espressione dell’integrina CD11c, dalla ridotta capacità di trasmigrazione e dalla minore produzione di citochine dopo stimolazione. Al contrario, nessuna variazione è stata individuata nell’immunofenotipo di monociti isolati in soggetti con altri deficit genetici di HDL. A conferma in vivo di quanto individuato precedentemente non è stata trovata alcuna differenza nella FMD tra portatori di deficit genetico di LCAT e controlli. Conclusioni Nonostante le ridotte concentrazioni plasmatiche di HDL-C, il deficit di LCAT non è associato a una maggiore disfunzione endoteliale dovuta all'aumentata efficacia delle particelle HDL nella stimolazione della produzione di NO endoteliale e nell'inibizione dell'espressione delle molecole di adesione, nonché al ridotto potenziale pro-infiammatorio dei monociti dei portatori.