RAZIONALE. La melatonina (MLT) è un potente neurormone prodotto in tracce dal triptofano nella ghiandola pineale dei mammiferi e coinvolto in molte funzioni fisiologiche: la regolazione dei ritmi circadiani di sonno-veglia, l’immunostimolazione, la difesa antiossidante e dai tumori (1). Le piante producono MLT con funzioni simili: aumentare la resistenza allo stress, regolare i ritmi circadiani, promuovere la germinazione e la maturazione. Anche lieviti come Saccaromyces cerevisiae e altri ceppi producono MLT durante la vinificazione. Lo scopo della ricerca è ottimizzare una procedura analitica per identificare e quantificare l’insieme dei metaboliti indolici del triptofano (indoloma) in matrici complesse vegetali e animali, per selezionare microrganismi alto-produttori di MLT per l’alimentazione, misurare la farmacocinetica di MLT somministrata secondo diverse vie e formulazioni farmaceutiche a confronto con un kit ELISA e studiare l’indoloma plasmatico di soggetti sottoposti a deregolazione dei cicli di buio-luce. MATERIALI E METODI. L’analisi impiega un sistema di cromatografia liquida – spettrometria di massa composto da un cromatografo Dionex UltiMate® 3000 LC Systems (con autocampionatore, pompa binaria e termostato) e da uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo AB Sciex 3200 QTRAP®. La colonna UPLC è una Agilent Zorbax® Bonus-RP 80A Amide (3x100 mm; 3,5 μm). Come standard interni sono utilizzati la 5-F-Triptamina per tutti gli indoli, il D5-Ar-Triptofano e la OCD3-MLT per i rispettivi analiti. La separazione cromatografica è ottenuta con un gradiente di acido formico allo 0,1% e formiato di ammonio 5 mM in acqua (A) e acido formico 0,1% in metanolo (B), flusso 0,4 ml / min, volume di iniezione 10 μl, tempo totale di analisi 10 min. La preparazione dei campioni impiega la precipitazione delle proteine con acetonitrile - 0,1% acido formico e la SPE con cartucce Supelco HybridSPE-Phospholipid (30mg, 1 ml). RISULTATI. La scelta delle transizioni analitiche e delle condizioni strumentali ottimali è stata ottenuta con lo studio preliminare mediante infusione in modalità di ionizzazione positiva di 11 composti (soluzioni singole, ~0,8 nM). Sono state misurate, con la funzione Ramp del software Analyst, le curve del Declustering Potential (DP) dello strumento (intervallo di V tra 0 e 70-90 V) e le curve di abbondanza dei frammenti in funzione dell’energia di collisione (curve di breakdown nell’intervallo di V tra 0 e 50-70 V). Tutte le elaborazioni sono state eseguite, a partire dai dati del software Analyst esportati come file .txt, in fogli di calcolo personalizzati (2), che calcolano i valori dei potenziali strumentali corrispondenti alla resa massima dei frammenti ionici identificati come reporter analitici, che sono stati poi utilizzati nel metodo finale. Il metodo cromatografico sviluppato separa e analizza 11 composti indolici in 10 min, con curve di calibrazione lineari (R2>0,998) nei due intervalli utili di concentrazione 0,012-1,25 ng (curva bassa) e 1,25-10 ng (curva alta). La presenza di triptofano ad elevate concentrazioni (69,7 e 18,4 µg/ml, rispettivamente) in terreni YPD e YNB utilizzati per la fermentazione di lieviti è stata confermata, mentre tutti gli altri indoli ricercati sono risultati assenti. In estratti metanolici di farina di semi di soia è stato misurato triptofano libero (2,72 e 3,12 mg/g) e sono state identificate tracce di N-acetil-5OH-Triptamina (0,16 e 0,16 µg/g) e di MLT (5,65 e 0,95 µg/g). Questo metodo ha inoltre consentito di quantificare MLT nel plasma per lo studio di diverse formulazioni farmaceutiche e per la valutazione dei suoi ritmi circadiani nell’uomo. 1. Lionella Palego, Laura Betti, Alessandra Rossi, Gino Giannaccini. Journal of Amino Acids Volume 2016, Article ID 8952520, 13 pageshttp://dx.doi.org/10.1155/2016/8952520 2. Rubino et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 22(23), pp. 3935–3948. doi: 10.1002/rcm.3810.

Metodo UPLC-MS-MS con diluizione isotopica per l’analisi di melatonina, triptofano e metaboliti indolici correlati : applicazioni pilota a matrici complesse di origini vegetale ed umana / R. Paroni, M. Deicas, J. Rizzo, F. Calvi, G. Mistraletti, M. Samaja, M. Iriti, F.M. Rubino. ((Intervento presentato al 2. convegno Seminario di Spettrometria di Massa Dipartimento di Chimica UNITECH COSPECT tenutosi a Milano nel 2018.

Metodo UPLC-MS-MS con diluizione isotopica per l’analisi di melatonina, triptofano e metaboliti indolici correlati : applicazioni pilota a matrici complesse di origini vegetale ed umana

R. Paroni
Primo
;
J. Rizzo;G. Mistraletti;M. Samaja;M. Iriti
Penultimo
;
F.M. Rubino
Ultimo
2018

Abstract

RAZIONALE. La melatonina (MLT) è un potente neurormone prodotto in tracce dal triptofano nella ghiandola pineale dei mammiferi e coinvolto in molte funzioni fisiologiche: la regolazione dei ritmi circadiani di sonno-veglia, l’immunostimolazione, la difesa antiossidante e dai tumori (1). Le piante producono MLT con funzioni simili: aumentare la resistenza allo stress, regolare i ritmi circadiani, promuovere la germinazione e la maturazione. Anche lieviti come Saccaromyces cerevisiae e altri ceppi producono MLT durante la vinificazione. Lo scopo della ricerca è ottimizzare una procedura analitica per identificare e quantificare l’insieme dei metaboliti indolici del triptofano (indoloma) in matrici complesse vegetali e animali, per selezionare microrganismi alto-produttori di MLT per l’alimentazione, misurare la farmacocinetica di MLT somministrata secondo diverse vie e formulazioni farmaceutiche a confronto con un kit ELISA e studiare l’indoloma plasmatico di soggetti sottoposti a deregolazione dei cicli di buio-luce. MATERIALI E METODI. L’analisi impiega un sistema di cromatografia liquida – spettrometria di massa composto da un cromatografo Dionex UltiMate® 3000 LC Systems (con autocampionatore, pompa binaria e termostato) e da uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo AB Sciex 3200 QTRAP®. La colonna UPLC è una Agilent Zorbax® Bonus-RP 80A Amide (3x100 mm; 3,5 μm). Come standard interni sono utilizzati la 5-F-Triptamina per tutti gli indoli, il D5-Ar-Triptofano e la OCD3-MLT per i rispettivi analiti. La separazione cromatografica è ottenuta con un gradiente di acido formico allo 0,1% e formiato di ammonio 5 mM in acqua (A) e acido formico 0,1% in metanolo (B), flusso 0,4 ml / min, volume di iniezione 10 μl, tempo totale di analisi 10 min. La preparazione dei campioni impiega la precipitazione delle proteine con acetonitrile - 0,1% acido formico e la SPE con cartucce Supelco HybridSPE-Phospholipid (30mg, 1 ml). RISULTATI. La scelta delle transizioni analitiche e delle condizioni strumentali ottimali è stata ottenuta con lo studio preliminare mediante infusione in modalità di ionizzazione positiva di 11 composti (soluzioni singole, ~0,8 nM). Sono state misurate, con la funzione Ramp del software Analyst, le curve del Declustering Potential (DP) dello strumento (intervallo di V tra 0 e 70-90 V) e le curve di abbondanza dei frammenti in funzione dell’energia di collisione (curve di breakdown nell’intervallo di V tra 0 e 50-70 V). Tutte le elaborazioni sono state eseguite, a partire dai dati del software Analyst esportati come file .txt, in fogli di calcolo personalizzati (2), che calcolano i valori dei potenziali strumentali corrispondenti alla resa massima dei frammenti ionici identificati come reporter analitici, che sono stati poi utilizzati nel metodo finale. Il metodo cromatografico sviluppato separa e analizza 11 composti indolici in 10 min, con curve di calibrazione lineari (R2>0,998) nei due intervalli utili di concentrazione 0,012-1,25 ng (curva bassa) e 1,25-10 ng (curva alta). La presenza di triptofano ad elevate concentrazioni (69,7 e 18,4 µg/ml, rispettivamente) in terreni YPD e YNB utilizzati per la fermentazione di lieviti è stata confermata, mentre tutti gli altri indoli ricercati sono risultati assenti. In estratti metanolici di farina di semi di soia è stato misurato triptofano libero (2,72 e 3,12 mg/g) e sono state identificate tracce di N-acetil-5OH-Triptamina (0,16 e 0,16 µg/g) e di MLT (5,65 e 0,95 µg/g). Questo metodo ha inoltre consentito di quantificare MLT nel plasma per lo studio di diverse formulazioni farmaceutiche e per la valutazione dei suoi ritmi circadiani nell’uomo. 1. Lionella Palego, Laura Betti, Alessandra Rossi, Gino Giannaccini. Journal of Amino Acids Volume 2016, Article ID 8952520, 13 pageshttp://dx.doi.org/10.1155/2016/8952520 2. Rubino et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 22(23), pp. 3935–3948. doi: 10.1002/rcm.3810.
21-giu-2018
HPLC; tandem mass spectrometry; tryptophan; melatonin
Settore CHIM/01 - Chimica Analitica
Settore BIO/12 - Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica
Università degli Studi di Milano
Metodo UPLC-MS-MS con diluizione isotopica per l’analisi di melatonina, triptofano e metaboliti indolici correlati : applicazioni pilota a matrici complesse di origini vegetale ed umana / R. Paroni, M. Deicas, J. Rizzo, F. Calvi, G. Mistraletti, M. Samaja, M. Iriti, F.M. Rubino. ((Intervento presentato al 2. convegno Seminario di Spettrometria di Massa Dipartimento di Chimica UNITECH COSPECT tenutosi a Milano nel 2018.
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