EVOLUTION, COMPARATIVE GENOMICS AND GENOMIC EPIDEMIOLOGY OF BACTERIA OF PUBLIC HEALTH IMPORTANCE

The present thesis is focused on genomic epidemiology of bacterial hospital infections. The hospital environment is unique, as it concentrates a high number of bacterial agents, frequent antibiotic use, and patients with weak immune systems. This combination favours the development and selection of antibiotic resistant strains and the spread of opportunistic infections: in general the thriving of nosocomial pathogens. Genomics and evolutionary approaches have emerged as the cutting edge tools for studying this kind of infections, allowing to study the genomic features of bacterial strains and their evolution. Thanks to the possibility to sequence DNA at a constantly cheaper price, research projects are supported by a growing number of genomes and a considerable amount of genomic data is available in the databases, expanding the amount of possible investigations that can be performed. The first work presented here describes the evolution of the Clonal Complex 258 (CC258) of Klebsiella pneumoniae. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) allowed to reconstruct the global phylogeny of the entire species and to collocate the CC258 in its evolutionary context. Furthermore, it was possible to detect the presence of a 1.3 Mb recombination in the genomes of the clade in analysis. A molecular clock approach allowed to date this and other previously discovered recombination events. These findings were used to complete the picture of the evolutionary history of CC258, which is characterized by frequent macro-recombination events. A quick evolutive strategy characterized by exchange of high amount of information is a common feature to other nosocomial pathogens, which develop “superbug” phenotypes. Although common, the macro-recombination evolution model is not shared by all nosocomial infection bacteria. One exception is the SMAL strain of Acinetobacter baumannii, presented in another subproject of this thesis. In this work, the genomes of Sequence Type (ST) 78 of A. baumannii were analyzed. Phylogeny and comparative genomics revealed the presence of two different clades within the ST, presenting different evolutive “lifestyles”. One group (containing the SMAL genomes) was characterized by a lower gene content variability and by the presence of a higher copy number of insertion sequences (ISs). One IS interrupts the comEC/rec2 gene in all the SMAL genomes. This gene codes for a protein involved in the exogenous DNA importation, thus its inactivation limits the gene exchange, suggesting an explanation for the low genomic plasticity. In another work presented in this document, genomic epidemiology was applied to reconstruct the spreading routes of a K. pneumoniae epidemic event in an hospital intensive care unit. At first, a phylogenetic approach was used to separate the isolates that belonged to the outbreak from the sporadic ones. Then the isolation dates and genomic SNPs allowed to build a genomic network, which modelled the chain of infection events in the ward. The reconstruction suggested a star-like diffusion of the pathogen from patient zero to the other infected ones, thus revealing a systematic error in the biosafety procedures of the hospital. This almost-forensic application of genomic epidemiology was also used in two other works presented, both of them concerning the reconstruction of food-borne infections. In one of the works, focused on Salmonella enterica, only synonymous SNPs were used as input to a phylogenetic based investigation, in order to filter out pathoadaptative mutations. In the other article, epidemiological data, molecular typing and SNP-based phylogeny were used to investigate the infection of nine Listeria monocytogenes isolates, which were believed to be part of the same outbreak and in the end proved to be genomically unrelated. Lastly, a review paper on genomic epidemiology is also presented. The article is focused on the latest high impact publications analyzing the genome evolution of bacterial pathogens as well as the propagation dynamics of epidemic outbreaks in very short periods of time. The article also describes the latest historical epidemiological studies, which are possible thanks to modern DNA isolation and sequencing technologies.

La presente tesi è incentrata sull'epidemiologia genomica delle infezioni batteriche ospedaliere. L'ambiente ospedaliero è peculiare, in quanto al suo interno si concentrano un elevato numero di agenti batterici, pazienti con un sistema immunitario debole e un uso massiccio di sostanze antimicrobiche. Questa combinazione favorisce lo sviluppo e la selezione di ceppi resistenti agli antibiotici e la diffusione di infezioni opportunistiche: in generale il prosperare dei patogeni nosocomiali. Alcune tecniche all'avanguardia per lo studio di questo tipo di infezioni sono basate sull’uso della genomica e di approcci evoluzionistici: esse permettono di conoscere le caratteristiche genomiche dei ceppi batterici e di ricostruire la loro storia evolutiva. Grazie alla possibilità di sequenziare il DNA ad un prezzo sempre più economico, i progetti di ricerca sono supportati da un numero sempre crescente di genomi e i dati genomici depositati nelle banche dati sono in crescita esponenziale: questo rende possibile eseguire una varietà sempre maggiore di analisi. Il primo lavoro qui riportato descrive l'evoluzione del Clonal Complex 258 (CC258) di Klebsiella pneumoniae. Le mutazioni puntiformi (single nucleotide polymorphism, SNP) hanno permesso di ricostruire la filogenesi globale di tutta la specie e di collocare il CC258 nel suo contesto evolutivo. Successivamente, è stato possibile rilevare la presenza di una ricombinazione di 1,3 Mb nei genomi del clade in analisi. Un’analisi del molecular clock ha poi consentito di datare sia questo che gli altri eventi di ricombinazione scoperti in lavori precedenti. Questi risultati sono stati usati per completare il quadro della storia evolutiva del CC258, caratterizzata da frequenti eventi di macro-ricombinazione. Un’evoluzione rapida e caratterizzata da scambi di elevate quantità di informazioni genomiche è una caratteristica comune ad altri patogeni nosocomiali che sviluppano fenotipi da "superbatteri". Sebbene frequente, il modello di evoluzione per macro-ricombinazioni non è comune a tutti i batteri responsabili di infezioni nosocomiali. Un’eccezione è il ceppo SMAL di Acinetobacter baumannii, presentato in un altro sottoprogetto di questa tesi. In questo lavoro sono stati analizzati i genomi del sequence type (ST) 78 di A. baumannii. La filogenesi e la genomica comparativa hanno rivelato la presenza di due differenti cladi all'interno del ST che presentano differenti "stili" evolutivi. Un gruppo (contenente i genomi SMAL) è caratterizzato da una minore variabilità del contenuto genico e dalla presenza di un numero più elevato di copie di insertion sequence (IS). Una IS interrompe il gene comEC/rec2 in tutti i genomi SMAL. Questo gene codifica per una proteina coinvolta nell’acquisizione del DNA esogeno, quindi la sua inattivazione limita lo scambio di geni. Questo suggerisce una spiegazione per la bassa plasticità genomica. In un altro lavoro presentato in questa tesi, l'epidemiologia genomica è stata applicata per ricostruire la diffusione di un focolaio epidemico di K. pneumoniae in un’unità di terapia intensiva ospedaliera. In un primo momento, è stato utilizzato un approccio filogenetico per separare gli isolati appartenenti all'epidemia da quelli sporadici. Poi le date di isolamento e gli SNP genomici hanno permesso di costruire una rete genomica che modellasse la propagazione delle infezioni nel reparto. La ricostruzione ha indicato una diffusione radiale del patogeno dal paziente zero a tutti gli altri infetti, rivelando così un errore sistematico nelle procedure di biosicurezza dell'ospedale. Questa applicazione quasi forense dell'epidemiologia genomica è stata utilizzata anche in altri due lavori qui presentati, entrambi riguardanti la ricostruzione di infezioni alimentari. In uno degli articoli, incentrato su Salmonella enterica, l’analisi filogenetica è stata eseguita solamente con gli SNP sinonimi al fine di filtrare le mutazioni patoadattative. Nell'altro lavoro sono stati utilizzati dati epidemiologici, tipizzazione molecolare e filogenesi basata sugli SNP per studiare l'infezione di nove isolati di Listeria monocytogenes, che si ritenevano essere parte dello stesso focolaio e alla fine sono risultati genomicamente non correlati. Infine, viene qui presentato anche un articolo di review riguardante l'epidemiologia genomica. L'articolo è focalizzato sulle ultime pubblicazioni ad alto impatto che analizzano l'evoluzione genomica degli agenti patogeni batterici e le dinamiche di propagazione delle epidemie in brevi periodi di tempo. L'articolo descrive, infine, le ultime ricostruzioni epidemiologiche a livello storico, che sono possibili grazie alle moderne tecnologie di isolamento e sequenza del DNA.