EQUINE AND BOVINE MICROVESICLES DERIVED FROM AMNIOTIC PROGENITOR CELLS IN REGENERATIVE AND REPRODUCTIVE TOPICS

During this PhD project, studies were carried out to understand the ability of amniotic mesenchymal cells (AMCs) to act by paracrine mechanism. At first, AMCs and their conditioned medium (CM) were investigated in an in vitro model using equine endometrial cells (EDCs) as target. Proliferation of EDCs was studied co-culturing them with AMCs in a trans-well system or in presence of AMC-CM. In both conditions, there was a significant increase in EDC proliferation rate, defining the crucial role of factors secreted by AMCs in stem cells action. CM is composed of soluble factors and no-soluble factors as microvesicles (MVs). In this context, in the second step of this project, the presence and the type of AMC-MVs were identified to understand their role in regenerative medicine. The production of MVs was optimized through a CM ultracentrifugation at 100.000 g for 1 hour. Microvesicle production from equine AMCs was 2550±71 particles/cell, with a mean dimension of 258±55 nm. The transmission electron microscopy confirmed the presence of extra-cellular vesicles that were classified as shedding vesicles for their size and modality of secretion. In order to understand if endometrial cells (EDCs) tendon cells (TNCs) were target of these MVs, an incorporation study was performed labelling MVs with a lipophilic fluorochrome such as PKH-26. By a dose-response curve, the optimal conditions of incorporation were at 72 h at a concentration of 40x106 MVs/ml for EDCs, and at 24-72 h at a concentration of 40x106 MVs/ml for TNCs. In order to study MVs ability to counteract an in vitro inflammation, EDCs and TNCs challenged with LPS and treated with MVs were evaluated by viability cell tests, by expression of some pro-inflammatory genes, and by release of respective cytokines. For both cell types, the apoptosis rate increased dramatically in cells treated with LPS if compared to the control (CTR). LPS significantly upregulated the expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β in EDCs and of MMP-1, MMP-9, MMP-13 and TNF-α in TNCs. MVs were able to counteract the action of LPS, decreasing the apoptosis rate and reducing in the expression levels of the pro-inflammatory genes in both cell lines. Coherent results were obtained through the analysis of pro-inflammatory (TNF-β and IL-6) and anti-inflammatory (TGF-α) cytokines released by EDCs in the culture medium, confirming the ability of MVs to transport molecules able to counteract the stress induced by LPS. Since MVs contain various active molecules, the presence of three miRNAs (miR-335, miR-146a, and miR-26a-2) was investigated, as they are involved in the regulation of inflammation. The selected miRNAs have been found in both AMCs and their MVs, so the previously observed downregulation of gene expression could be correlated to miRNA transfer from MVs to target cells. Moreover, the ability of MVs to inhibit peripheral blood mononuclear cell (PBMC) was evaluated, but MVs, also after lysis by sonication to release their content, were not able to inhibit PBMC proliferation despite to CM and SN. These results led to hypothesize that MVs brought to the target cells some molecules able to counteract the inflammatory situation due to the LPS but, taking into account the lack of their immunomodulatory action, probably, for an in vivo healing, soluble factor of CM are necessary too. Paracrine mechanism are essential also in maternal-fetal communication. In this context, we studied these mechanisms during bovine in vitro embryo production. Different components of secretome (CM, SN and MVs) from bovine AMCs and EDCs were supplemented to the embryo culture media at different days of culture. The results demonstrated that the day 5 of culture is the best time point for the supplementation of these components and that AMCs-MVs provided the best environment for the embryo concerning the blastocyst quality. These data were confirmed by the evaluation of genes involved in apoptosis and reactive oxygen species protection. The reasons for which the MVs of AMCs have proved better than those secreted by EDCs are not yet known but it is likely that in vitro culture of EDCs in monolayer may induce a de-differentiation that alters the quality of their secretion. As conclusion of this project, it is possible to speculate that AMCs are fascinating in view of producing off-the-shelf products, at low cost, and their use in regenerative medicine for their capacity to carry information to the target cells. The MVs may offer a new therapeutic cell-free tool in nanomedicine.

Durante questo progetto di dottorato sono stati condotti studi per comprendere la capacità delle cellule mesenchimali amniotiche (AMCs) di agire attraverso meccanismi paracrini. La prima fase del disegno sperimentale ha valutato l’efficacia delle AMCs sulla proliferazione delle cellule endometriali (EDCs) in assenza di un contatto cellula-cellula. Le EDCs sono state co-coltivate in un sistema trans-well con le AMCs o sono state coltivate in presenza del loro medium condizionato (CM). In entrambe le condizioni sperimentali è stato osservato un aumento del tasso di proliferazione delle EDCs definendo, così, il ruolo cruciale dei fattori secreti dalle AMCs come mediatori dell'azione delle cellule staminali. Il CM è composto da fattori solubili e non-solubili rappresentati da microvescicole (MVs). Per capire il ruolo delle MVs e del loro contenuto nell’azione paracrina, la seconda fase del disegno sperimentale è stata incentrata sull’individuazione del tipo di MVs secrete dalle AMCs e sulla loro efficacia in processi infiammatori in vitro su due importanti modelli sperimentali nella specie equina quali l’endometrio ed il tendine. La produzione di MVs è stata ottimizzata attraverso un’ultracentrifugazione del CM a 100.000 g per 1 ora. Attraverso lo strumento Nanosight è stato calcolato che la produzione di MVs da AMCs equine è di circa 2550±71 particelle/cellula, con una dimensione media di 258±55 nm. La microscopia elettronica a trasmissione ha confermato la presenza di vescicole cellulari che per dimensioni e modalità di secrezione sono state classificate come shedding vesicles. Per capire se le cellule endometriali (EDCs) e tendinee (TNCs) fossero target delle MVs secrete dalle AMCs, è stata studiata l’incorporazione delle medesime dopo marcatura con un fluorocromo lipofilico quale il PKH-26. Dopo uno studio di una curva dose-risposta è stato osservato che la dose ottimale per l'incorporazione di MVs in EDCs è stata di 40x106 MVs/ml a 72 h e per le TNCs di 40x106 MVs/ml a 24-48h. Per esaminare l'abilità delle MVs nel contrastare un processo infiammatorio, entrambe le linee cellulari sono state stressate in vitro con LPS e trattate con MVs. La vitalità cellulare, l'espressione di alcuni geni pro-infiammatori ed il rilascio delle rispettive citochine sono stati i parametri impiegati per valutare l’efficacia delle MVs. Per entrambe le linee cellulari, il tasso di apoptosi è drammaticamente salito nelle cellule trattate con LPS, rispetto al controllo (CTR). LPS ha indotto un aumento significativo dell'espressione di TNF-α, IL-6 e IL-1β in EDCs e di MMP-1, MMP-9, MMP-13 e TNF-α in TNCs. Le MVs sono state in grado di contrastare l'effetto di LPS, diminuendo il tasso di apoptosi in entrambe le linee cellulari e riducendo il livello di espressione dei geni pro-infiammatori. Una conferma di questi dati è stata ottenuta attraverso l'analisi delle citochine pro-infiammatorie (TNF-β and IL-6) ed anti-infiammatorie (TGF-α) rilasciate dalle EDCs nel terreno di coltura, confermando l'abilità delle MVs di trasportare molecole capaci di contrastare la risposta infiammatoria in cellule stressate con LPS. Data l'importanza del contenuto in miRNA delle MVs, sia nelle AMCs sia nelle loro MVs è stata studiata la presenza di tre miRNA (miR-335, miR-146a, and miR-26a-2) coinvolti nella regolazione dei processi infiammatori. Questi tre miRNA sono stati identificati sia nelle AMCs sia nelle MVs, di conseguenza, è possibile ipotizzare che l'espressione genica dopo infiammazione con LPS e trattamento con MVs possa essere stato modulato dal trasferimento di miRNAs dalle MVs alle cellule target. Successivamente a questi studi, si è tentato di capire quanto in un processo rigenerativo possa essere imputato alle MVs e quanto ai fattori solubili presenti nel CM e, a questo proposito, è stata valutata l’abilità delle MVs di inibire la proliferazione delle cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC). La loro azione è stata comparata a quello del CM e del sovranatante (SN) ottenuto dal CM dopo scorporazione delle MVs. Il CM ed il SN hanno manifestato capacità immunosoppressiva ma, anche dopo un trattamento di sonicazione al fine del rilascio del loro contenuto, le MVs non hanno dimostrato quest’abilità. Questi risultati portano a dedurre che le MVs sono in grado di trasportare informazioni alle cellule target attraverso molecole capaci di contrastare l'effetto infiammatorio dovuto all'uso di LPS ma, tenendo in considerazione la mancanza di effetto immunomodulatorio, probabilmente in vivo la loro azione è integrata anche dalla presenza dei fattori solubili presenti nel CM. I meccanismi paracrini materno-fetali sono di vitale importanza ai fini dell’instaurarsi di una gravidanza, per cui si è ritenuto interessante studiare questi meccanismi durante la produzione in vitro di embrioni bovini. Le differenti componenti del secretoma (CM, SN e MVs) ottenute da AMCs ed EDCs bovine sono state aggiunte al terreno di coltura embrionale a differenti giorni di coltura. I risultati hanno dimostrato che il giorno 5 è il migliore momento per la supplementazione e che le MVs di AMCs portano a migliori risultati qualitativi. Questi dati sono stati confermati dalla valutazione di alcuni geni coinvolti nell'apoptosi e nella protezione contro specie reattive dell'ossigeno. I motivi per i quali le MVs di AMCs si siano dimostrate migliori di quelle secrete dalle EDCs non sono ancora conosciuti ma è probabile che le EDCs coltivate in monostrato in vitro vadano incontro a de-differenziamento che altera la qualità del loro secreto. In conclusione, è possibile affermare che le AMCs sono una linea cellulare affascinante in quanto derivano da materiale di scarto biologico, e quindi a basso costo, e possono essere impiegate in medicina rigenerativa per la loro capacità di trasportare informazioni alle cellule target. Le MVs possono offrire un nuovo strumento terapeutico privo di cellule nell’ambito della nanomedicina.