SORVEGLIANZA DEL MORBILLO ED APPROCCI INNOVATIVI DI FILOGENETICA NELL'AMBITO DEL GLOBAL MEASLES STRATEGIC PLAN 2012-2020

1. Introduction Measles and rubella are infectious diseases and humans are the only reservoir of these infections. effective vaccines are available with the potential for measles (MV) and rubella (RuV) virus eradication. according to the World health Organisation guidelines, a national plan was approved in Italy in 2013 to achieve the MV/RuV elimination by 2015, and active MV/RuV integrated surveillance initiated. Towards this purpose, a regional laboratory centre was set up on July 2013 in Lombardy, Northern Italy. 2. The aim The aim of this paper is to describe the epidemiological and virological trends of measles virus in Lombardy in the biennium 2013-2014. And to describe the genotype circulation in Lombardy. 3. Materials and methods Urine and saliva samples were collected between July 2013 and November 2014, in order to find the origins and routes of wild type measles virus circulation. Real-time RT-PCR was performed for the identification of nucleic acids of measles virus and the virus rubella of patients from Lombardy region. To assess the genetic variability and molecular evolution of morbillivirus circulating in Lombardia all positive samples were subjected to nested PCR for the amplification of a fragment of the gene N. The sequences were genotyped by comparing the fragment coding for the carboxyl terminus of the nucleoprotein (450 nucleotides) with that one of the WHO reference strains. 4. Results From July 2013 to November 2014 in Lombardy were reported 528 measles cases (possible, probable and confirmed) in Lombardy. The majority of cases (359 cases, 68%) occurred in the age group 15-39 year old. As a regional referral center for surveillance integrated measles-rubella, by July 2013 to September 2014, we were collected 115 suspected cases of MV/RuV for virological analysis. Laboratory analysis of samples collected from these 115 suspected cases revealed that 54.8% (63/115) were MV-positive by RT-PCR. Most 60.3% (38/63) MV-positive cases were unvaccinated. Highest number of confirmed cases (76.2%; 48/63) was observed in the age group between 15 and 39, followed by the age group 40-64 years, 12.7% (8/63). The analysis of the viral genotype was completed successfully for 53 of the 63 confirmed cases. From the year 2012 to the year 2013 phylogenetic analysis of measles sequences showed a predominant circulation of the D8 genotype. During the same period B3 and D9 genotypes were also detected. 5. Conclusions Genetic characterization of wild-type MV provides a means to study the transmission pathways of the virus, and is an essential component of laboratory-based surveillance. Knowledge of currently circulating measles virus genotype in Lombardy will help in monitoring the success of the measles elimination programme and will contribute to evaluate the effectiveness of future vaccination campaigns.

1. Introduzione Il morbillo è una malattia infettiva causata da un virus del genere morbillivirus (famiglia dei Paramixovidae) molto contagiosa, prevenibile con la vaccinazione, che presenta i requisiti necessari per l’eliminazione (trasmissione esclusivamente interumana, virus geneticamente stabile, assenza di serbatoi animali o ambientali, periodo di contagiosità breve, immunità permanente conferita dall’infezione, disponibilità di un vaccino efficace e sicuro). In assenza di misure preventive la malattie può avere un grave impatto sulla salute della popolazione. In linea con gli obiettivi della Regione Europea dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), il 23 marzo 2011, è stato approvato il Piano Nazionale per l’Eliminazione del Morbillo e della Rosolia congenita (PNEMoRc) 2010-20. Nel piano, accanto a misure mirate atte ad incrementare le coperture vaccinali per due dosi di vaccino trivalente contro morbillo, parotite e rosolia (MPR), per raggiungere gli obiettivi di eliminazione viene sottolineata l’importanza della sorveglianza. In previsione dell’obiettivo di eliminazione risulta infatti fondamentale un sistema di sorveglianza sensibile in grado, non solo di individuare tempestivamente tutti i nuovi casi di morbillo, ma anche di valutare la circolazione dei diversi genotipi virali. Nei paesi in via di eliminazione la sorveglianza molecolare gioca dunque un ruolo fondamentale per valutare la circolazione dei ceppi endemici, identificare i casi di importazione e la loro provenienza. 2. Scopo Descrivere il profilo epidemiologico e virologico del morbillo in Lombardia nel biennio 2013-2014 e caratterizzare molecolarmente i ceppi di morbillivirus al fine di genotipizzarli, analizzarli filogeneticamente e studiarne le caratteristiche evolutive. 3. Materiali e metodi Sono stati analizzati i campioni respiratori e/o da urina provenienti da pazienti con una diagnosi sospetta di morbillo, raccolti nell’ambito del sistema di sorveglianza integrata per il morbillo e la rosolia della regione Lombardia da luglio 2013 a novembre 2014. I campioni sono stati sottoposti a estrazione dell'RNA e a successiva amplificazione genica mediante real-time RT-PCR per l’identificazione degli acidi nucleici del virus del morbillo e del virus della rosolia. Per valutare la variabilità genetica e l’evoluzione molecolare dei morbillivirus circolanti in Lombardia tutti i campioni risultati positivi sono stati sottoposti a nested PCR per l’amplificazione di un frammento del gene N. gli amplificati sono stati sequenziati e l’analisi delle sequenze ottenute è stata condotta attraverso diversi programmi bioinformatici. 4. Risultati Da luglio 2013 a novembre 2014 in Lombardia sono stati segnalati 596 casi di morbillo, l’11.4% (68/596) delle segnalazioni di morbillo è risultato negativo agli esami di laboratorio e quindi classificato come non caso. Pertanto i casi di morbillo (possibili, probabili e confermati) in Lombardia nel periodo in studio sono stati complessivamente 528 (88,6%; 528/596). La maggior parte dei casi (359 casi, pari al 68%) si è verificata nella fascia di età 15-39 anni. Il 9% dei casi (47) è stato osservato in bambini sotto i cinque anni, di cui il 6,4% (3/47) in pazienti con meno di un anno. Complessivamente 401 casi segnalati (75,9%) erano non vaccinati, 50 casi (9,5%) avevano ricevuto una dose di vaccino e 3 (0,6%) due dosi. Come centro di riferimento regionale per la sorveglianza integrata morbillo-rosolia, da luglio 2013 a settembre 2014, abbiamo ricevuto e analizzato i campioni biologici (sangue, tampone naso/faringeo, urina) di 115 pazienti con sospetta infezione. Il 54,8% (63/115) dei casi è risultato positivo al virus del morbillo; nessun caso di rosolia è stato confermato. Il maggior numero di casi confermati (76,2%; 48/63) è stato osservato nella fascia d’età compresa tra i 15 e i 39, seguita dalla fascia d’età 40 - 64 anni con il 12,7% (8/63). il 60,3% (38/63) dei casi confermati non era vaccinato, il 27% (17/63) presentava uno stato vaccinale non noto. L’analisi del genotipo virale è stata ultimata con successo per 53 dei 63 casi confermati nel periodo in studio. Di questi, 42 (79,2%; 42/53) appartenevano al genotipo D8, 8 (15,1%; 8/53) al genotipo B3 e 3 (5,7%; 3/53) appartenevano al genotipo D9. Il genotipo prevalente è risultato il D8, circolante in tutto il periodo in studio. Il genotipo B3 è circolato nella primavera 2014 e ad agosto 2014. Tre casi di genotipo D9 sono stati identificati nei mesi di agosto e novembre 2013. L'albero, ottenuto dall’analisi delle sequenze D8, ha evidenziato la presenza di 4 cluster (1-4), i cluster 1 e 2 sono stati ulteriormente suddivisi in sub-cluster. Le sequenze della sorveglianza lombarda segregavano nei cluster 1 e 2, a loro volta suddivisi in 5 (1A-1E) e in 3 (2A – 2C) sub-cluster. L’analisi filogenetica delle sequenze B3 ha evidenziato la presenza di 7 cluster, il primo dei quali suddiviso in 2 sub-cluster. Le sequenze identificate in Lombardia clasterizzavano in 4 distinti cluster (1-4); il cluster 1 è risultato a sua volta suddiviso in due sub -cluster (1A e 1B). L’albero, ottenuto dall’analisi delle sequenze D9, ha evidenziato la presenza di 4 cluster, il primo dei quali a sua volta suddiviso in 2 sub-cluster. Le sequenze lombarde segregavano nel cluster 1, sub-cluster 1A e 1B. I tassi medi evolutivi, calcolati mediante analisi dell’evolutionary rate, sono stati sono stati stimati pari a:  2.97 x 10 -6 subs/site/year (95% HPD: 1,6 – 4,5 x 10 -6 ) per le seuqneze D8  2,44 x 10 -6 subs/site/year (95% HPD: 1,3 – 3.7 x10 -6 ) per le sequenze B3  5,96 x 10 -6 subs/site/year (95% HPD: 2,2 – 10,7 x 10 -6 ) per le sequenze D9 Il valore di tMRCA per la radice albero del genotipo D8 risale a 18 anni fa, i ceppi isolati presso il nostro laboratorio appartenenti al cluster 1 condividevano un unico nodo significativo interno con un tMRCA medio stimato a circa 4 anni fa, le sequenze appartenenti al cluster 2 presentavano un tMRCA medio stimato risalente a 5 anni fa. Il valore di tMRCA per la radice dell’albero del genotipo B3 è risultato risalire a poco più di 12 anni fa. I tre isolati del genotipo D9 hanno mostrato un tMRCA significativo risalente a circa 5 anni fa, con una radice a 7 anni fa. Il Bayesian skyline plots (BSP) ottenuto dall’analisi dinamica delle sequenze ha rilevato che tutti e tre i genotipi presentano un andamento della popolazione virale sostanzialmente costante nel periodo in studio. L'analisi della pressione selettiva sito-specifica delle sequenze del genotipo D8 ha identificato la presenza di un codone sottoposto a selezione positiva, mentre 9 siti sono risultati sotto pressione selettiva negativa. Per le sequenze appartenenti al genotipo B3, l'analisi della pressione selettiva ha identificato 1 codone sottoposto a selezione positiva, mentre 7 siti sono risultati sotto pressione selettiva negativa Per quanto riguarda il genotipo D9, l’analisi ha indicato l'assenza di siti soggetti a pressione positiva e la presenza di 7 siti soggetti a pressione selettiva negativa. 5. Conclusioni I risultati ottenuti dal presente lavori di tesi hanno dimostrato che le ultime epidemie di morbillo (2013-2014) sono state sostenute da virus appartenenti ai genotipi D8 e B3 endemici nel territorio italiano dal biennio 2006-2007. Oltre ai ceppi autoctoni D8 e B3, è stata dimostrata la circolazione di ceppi D9 di recente introduzione nel territorio lombardo. L’approfondimento delle caratteristiche geniche del virus in studio ha permesso di valutare la circolazione dei diversi genotipi e studiarne le caratteristiche molecolari. Metodi filogenetici computazionali sono stati utilizzati per determinare alcune caratteristiche relative alla comparsa del virus del morbillo e della sua diffusione nella popolazione umana. Attraverso lo studio dell’evoluzione molecolare del virus è stato possibile definire sia il momento in cui i diversi genotipi virali hanno cominciato a differenziarsi (mediante il calcolo del tasso evolutivo), sia di valutare le caratteristiche dell’espansione spazio-temporale del virus. Inoltre è stata valutata la pressione selettiva che agisce sulla regione C-terminale del gene N. La valutazione del profilo genetico dei ceppi virali circolanti fornisce informazioni importanti sull’origine di focolai epidemici e risulta un approccio in novativo fondamentale per la ricostruzione dei link epidemiologici. Il morbillo rappresenta un esempio paradigmatico di come le metodologie molecolari e bioinformatiche arricchiscano sia l’indagine epidemiologica sia l’attività di sorveglianza, entrambe volte al controllo della trasmissione del virus.