BACTERIAL ENZYMATIC ACTIVITIES AS POTENTIAL MARKERS FOR ASSESSING THE TECHNOLOGICAL PROPERTIES OF (UN)PROCESSED MILK

ABSTRACT Psychrotrophic bacteria are responsible for the highest spoilage of unprocessed or heated milk during storage because of their capacity to synthesize thermostable extracellular proteases and lipases. The activities of these enzymes lead to formation of off-odours/flavours, gelation of milk, lowering of milk foaming properties, loss of sensory quality and shortening of the shelf life. To date, still little is known about the specific proteolytic and lipolytic pathways of these thermostable enzymes. Initially we evaluated the enzymatic traits of 80 raw milk-associated psychrotrophic strains. Among psychrotrophic isolates, Pseudomonas were the most commonly occurring contaminants (78.75%) being Pseudomonas fluorescens the predominant isolated species (30.16 %), along with Enterobacteriaceae (21.25%), primarily Serratia marcescens (52.94 %). Forty-one of the psychrotrophic strains were positive for all the enzymatic activities. The highest number of positive strains for all incubation temperatures was found for the lipolytic activity (59), followed by proteolytic (31) and lecithinase (28) activities. The enzymatic traits varied among the Pseudomonas and Enterobacteriaceae strains and were markedly influenced by incubation temperature being 30 °C the optimal one. The aprX gene was detected in 19 out of 80 psychrotrohic strains and it resulted widespread among P. fluorescens strains (15 out of 18). The second part of the research was focused on the evaluation of spoilage potential of psychrotrophic strains by analyzing the production of volatile organic compounds (VOCs) and the release of free fatty acids (FFAs). From results of SPME-GC/MS analysis, different species of the genus Pseudomonas and Serratia marcescens produced a complex and strain-dependent VOCs profiles in UHT milk samples at different storage and time conditions. Fifty-six VOCs belonging to 7 chemical groups (aldehydes, ketones, fatty acids, esters, alcohols, sulphur compounds and hydrocarbons) were identified. Generally, the VOCs went to increase during the storage time both in the control and contaminated milk samples, some compounds being detected only in the latter samples. Compounds such as 3-methylbutan-2-ol, 3-methylhexan-2-ol, pentan-1-ol and 3,3-dimethylhexane were detectable only for P. fragi. P. rhodesiae was the only species producing pentane-2,3-dione, heptane and 3-methylhexane while hexane was released only by P. fluorescens. P. mosselii and P. fragi produced the highest number of sulphur compounds and alcohols, respectively. The highest number of FFAs and ketons was detected in the headspace of milk samples contaminated by P. rhodesiae and S. marcescens. P. fluorescens provided the lowest development of VOCs. 3-methylbutan-1-ol, 2 methylpropan-1-ol, 3-hydroxybutan-2-one, butane-2,3-dione and butanoic and hexanoic acids could be regarded as potential markers of psycrotrophic contamination useful for the early detection of milk bacterial spoilage. Regarding the release of FFAs, different quantities of these compounds have been released from milk fat by tested bacteria, between and within species, in relation to diverse capacity for production of lipolytic enzymes. Palmitic (16:0), oleic (18:1) and linoleic (18:2) acids levels were found to be the highest among the SFAs, MUFAs and PUFAs, respectively. P. fluorescens PS73 and P. fluorescens PS81 were the major FFAs producers, at 24 h and 4 days of incubation, respectively while H. alvei PS57 and P. fragi PS55 were the less active in lipid breakdown at both the incubation conditions. Lipases from psychrotrophic strains showed a variable range of specificity toward fatty acid esters with different fatty acid chain lengths, being P. fragi PS55, P. putida PS17, P. fluorescens PS14 and P. fulva PS10 the more active to hydrolyse triglycerides. Lipase from P. rhodesiae PS62 showed the highest hydrolytic resistance toward all tested fatty acid triglycerides. Finally, proteomic characterization of extracellular proteases of P. fluorescens strains has been performed. One thermostable protease of approximately 45 kDa was detected in each of the cell-free supernatant of the selected strains on a casein zymogram gel. After concentration by ultrafiltration (10 kDa), the protease extract of P. fluorescens PS19 showed a high proteolytic activity and two additional proteolytic bands with molecular masses of approximately 15 and 25 kDa on casein zymography. This extract was subjected to proteomic characterization by nLC/MS/MS analysis of both in gel and in solution digestion. Results showed the protease of 45 kDa to correspond to P. fluorescens AprX metalloprotease (acc. no. C9WKP6, UniProt). In addition, the same results leaded to recognize the 15 kDa protease as a fragment of this AprX metalloprotease. On the contrary, the 25 kDa protease showed no homology to any known protein of Pseudomonas spp. The characterization by LC/MS of the peptides profile generated by the action of thermostable proteases of the same strain on milk caseins is still under investigation. Overall, this study provides a better understanding of the enzymatic activities of psychrotrophic bacteria in milk.

RIASSUNTO I batteri psicrotrofi sono i principali responsabili del deterioramento del latte crudo o termotrattato poiché sono in grado di sintetizzare proteasi e lipasi extracellulari termostabili, causa di formazione di odori e sapori sgradevoli, fenomeni di gelificazione, riduzione delle proprietà schiumogene del latte, perdita di qualità sensoriale e riduzione della shelf-life. Ad oggi, non esiste ancora una sufficiente conoscenza degli specifici pathways proteolitici e lipolitici di questi enzimi termostabili. Inizialmente questo lavoro ha riguardato la caratterizzazione dell’attività enzimatica di 80 ceppi di psicrotrofi isolati da latte crudo. I batteri appartenenti al genere Pseudomonas sono stati i più isolati (78.75%) e Pseudomonas fluorescens è risultata la specie predominante (30.16%); tra le Enterobacteriaceae (21.25%), Serratia marcescens è stata la specie più frequentemente isolata (52.94%). Quarantuno ceppi di psicrotrofi mostravano tutte le attività enzimatiche. Il più alto numero di ceppi positivi a tutte le temperature di incubazione è stato osservato per l’attività lipolitica (59) e, a seguire, proteolitica (31) e lecitinasica; i tratti enzimatici variavano tra i ceppi di Pseudomonas e Enterobacteriaceae ed erano marcatamente influenzati dalla temperature di incubazione, essendo 30 °C quella ottimale. Il gene aprX è stato ritrovato in 19 ceppi di Pseudomonas ed è risultato esser diffuso tra i ceppi di P. fluorescens (15 su18). La seconda parte della ricerca è stata focalizzata sulla valutazione della produzione di composti organici volatili (VOCs) e del rilascio di acidi grassi liberi (FFAs) da ceppi di batteri psicrotrofi. Diverse specie del genere Pseudomonas e il ceppo Serratia marcescens hanno mostrato profili di VOCs complessi e dipendenti dal ceppo batterico inoculato in campioni di latte UHT, durante le differenti condizioni di incubazione. In particolare, sono stati identificati 56 VOCs appartenenti a aldeidi, chetoni, acidi grassi, alcoli, composti solforati e idrocarburi. Generalmente, il numero di VOCs tendeva ad incrementare con il progredire del tempo di incubazione, sia nel latte controllo non inoculato sia nei campioni di latte contaminati. Tra i VOCs rilevati, alcune molecole sono state individuate solo quando il latte era contaminato da uno specifico ceppo microbico. Nel dettaglio, 3-metilbutan-2-olo, 3-metilesan-2-olo, pentan-1-olo e 3,3-dimetilesano sono stati rilevati solo a seguito dello sviluppo di P. fragi. P. rhodesiae è stata l’unica specie a produrre pentano-2,3-dione, eptano e 3-metilesano, mentre l’esano è stato rilasciato solo in campioni di latte contaminati con P. fluorescens. La maggior produzione di composti solforati e alcoli è stata individuata nello spazio di testa del latte contaminato con P. mosselii e P. fragi, rispettivamente. Lo sviluppo e l’attività di P. rhodesiae e S. marcescens sono risultati associati ad un più alto numero di acidi grassi e chetoni mentre P. fluorescens ha mostrato la più scarsa produzione di composti volatili. Alcuni VOCs come 3-metilbutan-1-olo, 2-metilpropan-1-olo, 3-idrossibutan-2-one, butano-2,3-dione, acido butanoico ed acido esanoico potrebbero perciò rappresentare potenziali marker per il riconoscimento dell’attività enzimatica di batteri psicrotrofi e per la precoce individuazione del deterioramento del prodotto. Per quanto riguarda il rilascio di FFAs, diverse quantità di questi composti sono state rilasciate dai batteri psicrotrofi appartenenti a specie diverse e alla stessa specie conseguentemente alla diversa capacità di produrre lipasi. Gli acidi palmitico (16:0), oleico (18:1) e linoleico (18:2) sono risultati i più presenti tra gli acidi grassi saturi, monoinsaturi e polinsaturi. P. fluorescens PS73 e P. fluorescens PS81 sono state le specie che hanno prodotto la maggior quantità di FFAs, a 24 h e 4 giorni di incubazione, rispettivamente. Al contrario, H. alvei PS57 e P. fragi PS55 hanno rilasciato la minor quantità di FFAs ad entrambi i tempi di incubazione. Le lipasi dei ceppi di psicrotrofi hanno mostrato una specificità variabile nei riguardi degli esteri degli acidi grassi con diversa lunghezza della catena carboniosa. P. fragi PS55, P. putida PS17, P. fluorescens PS14 and P. fulva PS10 sono risultate le specie più attive nell’idrolisi dei trigliceridi. La lipasi del ceppo di P. rhodesiae PS62 ha mostrato la più scarsa capacità idrolitica verso tutti i trigliceridi testati. Infine, è stata effettuata la caratterizzazione proteomica di proteasi extracellulari di ceppi di P. fluorescens. Una proteasi termostabile di circa 45 kDa è stata individuata su casein zymogram gel in ciascun surnatante dei ceppi batterici selezionati. L’estratto enzimatico del ceppo P. fluorescens PS19, concentrato per ultrafiltrazione (10 kDa), ha mostrato un’elevata attività proteolitica e due ulteriori bande proteolitiche di circa 15 e 25 kDa. I risultati delle analisi nLC/MS/MS dopo digestione sia in gel che in solution hanno evidenziato che la proteasi di 45 kDa corrisponde ad una AprX metalloproteasi di P. fluorescens (acc. no. C9WKP6, UniProt). La proteasi di 15 kDa è stata riconosciuta come un frammento della stessa AprX metalloproteasi, mentre la proteasi di 25 kDa non ha mostrato nessuna omologia con alcuna delle proteine note di Pseudomonas. La caratterizzazione tramite LC/MS del profilo peptidico generato dall’azione delle proteasi termostabili dello stesso ceppo sulle frazioni caseiniche del latte è in corso di studio. In generale, questo studio fornisce ulteriori conoscenze per la lo studio delle attività enzimatiche di batteri psicrotrofi nel latte.