EXPRESSION ANALYSIS OF MICRORNA IN PROSTATE CANCER AND IDENTIFICATION OF NOVEL DIAGNOSTIC BIOMARKER

Introduction: Prostate cancer (PCa) is one of the most common cancers among men and the sixth cause of cancer-related death in men worldwide. The current diagnostic approach is based on serum measurement of prostate specific antigen (PSA) levels, despite recent clinical studies showed that did not considerably reduced mortality incidence in prostate cancer patients. In this scenario, we hypothesized that microRNAs (miRNAs) could be novel biomarkers for PCa disease. Aim of the study: We propose to identify miRNA signatures associated to PCa progression that could represent a novel generation of diagnostic biomarkers adjunctive to PSA, prognostic and predictive of cancer progression. Our experimental strategy included the use of normal or tumorigenic prostate cell lines, mouse model of PCa and patients’ series. Methods: Prostate cell lines: global miRNA expression analysis using a low-density array platform in PCa (LNCap, PC3, DU145) or non-tumorigenic cells (RWPE-1, BPH-1). Clinical series. Analysis of selected miRNAs in 58 PCa patients for which normal parenchyma and prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) was available. Correlation of molecular profiles to clinicopathological characteristics. Potential miRNA targets were investigated using a larger series of PCa patients arranged in tissue micro-arrays (TMAs). TRAMP mouse: global miRNA profiles were obtained from epithelial and stromal compartments of PIN or tumoral lesions. Primary cell lines: fibroblasts were obtained from prostate resection of PCa patients (n=10). Results: miRNA screening in cell lines provided a panel of 23 miRNAs that were then investigated in the 58 PCa patients. Thirteen miRNA displayed significant deregulation (p<0.05) in disease tissues. Specifically nine miRNAs (miR-135b,-193a-5p,-205,-224,-22,-34b,-34c-5p,-452, miR-886-3p) were progressively down-regulated during neoplastic progression (N-PIN-PCa). Conversely, miR-130a, -218, -532, -542-5p, -489 and let-7c displayed lower levels in PIN compared to normal prostate. A recognized target of miR-205, miR-218 and miR-224 is the Runt-related transcription factor 2 (RUNX2), a protein involved in metastatic dissemination to the bone. In our patients’ TMA, RUNX2 was overexpressed in tumoral cell nuclei (p<0.0001) and it was related to tumor size and capsular invasion. Moreover RUNX2 was inversely related to miRNA levels. TRAMP mice analysis has provided a signature of miRNAs (n=52) differentially expressed in epithelial and stromal compartments of PIN or PCa cells. Conclusions: Our results show a simultaneous loss of oncosuppressive miRNAs and increased RUNX2 expression in PCa tissues. This data is particularly relevant in disease progression monitoring, an aspect that will be studied in future project’s phases. Our analysis showed that miR-205 loss is a potential biomarker of aggressive disease. Furthermore, we identified nine miRNAs which expression is decreased from early stage of disease (PIN). Validation of this result in independent patients’ series could provide novel biomarkers of PCa useful as adjunts to PSA monitoring. Lastly, profound stromal miRNAs deregulation underlines the importance of tumour microenvironment in sustaining cancer cell survival and growth. Moreover this result suggest that targeting tumour stroma could represent an alternative strategy for anti-cancer therapies. Future studies are needed to shed light on this aspect.

Introduzione: Il tumore alla prostata (PCa) è una delle neoplasie più comuni tra gli uomini nel mondo occidentale e, globalmente, rappresenta la sesta causa di morte dovuta a cancro. L'approccio diagnostico attuale si basa sulla misurazione dei livelli sierici dell’antigene prostatico PSA (prostate specific antigen), nonostante recenti studi clinici abbiano dimostrato che questo marcatore non riduce significativamente la mortalità associata a PCa. In questo scenario abbiamo ipotizzato che i microRNA possano essere nuovi potenziali biomarcatori di PCa. Scopo del lavoro: L'identificazione di microRNA, coinvolti nella progressione neoplastica del tumore prostatico come nuovi biomarcatori diagnostici aggiuntivi al PSA, prognostici e predittivi di aggressività tumorale. La nostra strategia sperimentale ha previsto l’uso di linee cellulari di prostata non tumorigeniche e a diverso grado di malignità, modelli murini di carcinoma prostatico e casistiche di pazienti affetti da PCa. Materiali e metodi: Linee cellulari commerciali: analisi dell'espressione globale dei miRNA tramite piattaforma low-density array nelle linee di PCa (LNCap, PC3, DU145), normali o iperplastiche (RWPE-1 e BPH-1). Casistiche cliniche: analisi di miRNA selezionati, in un set di pazienti (n=58) nei tessuti di parenchima normale, pre-neoplastico (prostatic intraepithelial neoplasia, PIN) e tumorale. I risultati ottenuti sono stati correlati a parametri clinicopatologici dei pazienti. I potenziali target proteici dei miRNA selezionati sono stati valutati in una casistica più ampia mediante tissue micro-array (TMA). Modello murino transgenico TRAMP: analisi globale di espressione dei miRNA in ghiandole di PIN e tumorali, e nello stroma associato. Linee cellulari primarie: ottenimento di linee di fibroblasti derivate da resezioni chirurgiche di PCa (n=10). Risultati: Dallo screening nelle linee cellulari abbiamo selezionato 23 miRNA poi valutati nei 58 pazienti. Tredici miRNA hanno mostrato differenze di espressione significative (p<0.05). In particolare, nove miRNA (miR-135b,-193a-5p,-205,-224,-22,-34b,-34c-5p,-452,miR-886-3p) sono risultati progressivamente diminuiti nella progressione neoplastica (N-PIN-PCa). Viceversa, i miR-130a, -218, -532, -542-5p, -489 e let-7c hanno mostrato una diminuzione di espressione nel PIN rispetto al tessuto normale. È noto che i miR-205, miR-218, miR-224 abbiano come bersaglio proteico RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), un fattore di trascrizione coinvolto nel tropismo osseo di cellule metastatiche. La valutazione di RUNX2 nei TMA di prostata ha rivelato che la positività nucleare è specifica delle cellule tumorali (p<0.0001) e correla con l’estensione del tumore e con l'invasione capsulare. Inoltre il confronto tra l’espressione dei miRNA e RUNX2 ha mostrato correlazione inversa significativa. Dall’analisi del modello TRAMP abbiamo identificato un pannello di miRNA differenzialmente espressi tra le componenti epiteliali e stromali associate a PIN o PCa (n=52). Conclusioni: I nostri risultati mostrano una sinergica perdita di miRNA con funzione oncosoppressiva e contemporaneo aumento di RUNX2 nei tessuti di PCa. Questo dato ha importanti implicazioni a livello di progressione di malattia che sarà valutata in una successiva fase del progetto. Le nostre analisi hanno indicato il miR-205 come potenziale marcatore di aggressività di malattia. Hanno inoltre identificato 9 miRNA precocemente persi nelle lesioni precancerose (PIN) rispetto al parenchima sano. Studi in casistiche indipendenti potranno confermare queste molecole come nuovi biomarcatori di neoplasia da affiancare alla valutazione del PSA. Inoltre lo studio dei miRNA “stromali” ha evidenziato una profonda deregolazione di queste molecole nel microambiente tumorale rispetto a quello non neoplastico. Questo risultato sottolinea dal punto di vista molecolare l’importanza dello stroma nel sostenere la sopravvivenza e la crescita tumorale e fornisce una possibile strategia terapeutica alternativa, mirata alle cellule stromali anziché epiteliali per indurre regressione di malattia. Saranno necessari ulteriori studi per valutare il ruolo dei miRNA nell’interazione tra epitelio tumorale e stroma circostante.