Immortalizzazione reversibile e trasduzione di mesoangioblastidmd con un cromosoma artificiale esprimente la distrofina per la terapia cellulare della distrofia muscolare

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia genetica, causata dall’assenza della proteina distrofina, che causa un progressivo deterioramento del tessuto muscolare scheletrico. Questo progetto si propone di sviluppare un nuovo approccio di terapia cellulare autologo per la DMD, basato sul trapianto di mesoangioblasti (MABs, progenitori associati ai vasi) umani distrofici, il cui difetto genetico sia stato precedentemente corretto con un cromosoma artificiale umano (HAC) contenente l’intero locus della distrofina (DYS-HAC). Gli HACs presentano diversi vantaggi rispetto ai vettori normalmente impiegati nella terapia genica, tra cui il mantenimento in forma episomale e la capacità di contenere intere regioni geniche comprensive di elementi regolatori. Recentemente abbiamo dimostrato l’efficacia di trasferimento del DYS-HAC in MABs murini distrofici (mdx(DYSHAC) MABs). Gli mdx(DYS-HAC)MABs si sono mostrati in grado di colonizzare efficacemente il muscolo scheletrico di topi distrofici, producendo un considerevole numero di fibre esprimenti la distrofina le quali hanno permesso un significativo e stabile miglioramento morfologico e funzionale del fenotipo distrofico (Tedesco et al. Sci. trasl. Med. 2011). L’estensione di questo protocollo a mesoangioblasti umani (hMABs) non è direttamente possibile poichè in coltura i hMABs entrerebbero in senescenza dopo la selezione necessaria per isolare le cellule in cui il DYS-HAC è stato tarsferito. È necessario pertanto un processo di immortalizzazione reversibile che è stato ottenuto mediante trasduzione con vettori lentivirali “floxati” esprimenti hTERT(iresHSV1-TK) e Bmi-1(iresHSV1-TK), per impedire rispettivamentemte l’accorciamento dei telomeri e l’azione anti-proliferativa di p16. Popolazioni policlonali e clonali sono state selezionate per l’espressione di hTERT e Bmi-1 e quindi caratterizzate per la capacità proliferativa, la non tumorigenicità e il potenziale miogenico in vitro. In seguito la stessa strategia è stata adottata per immortalizzare i hMABs distrofici (DMD hMABs) prima del trasferimento di un nuovo DYS-HAC privato di transgeni immunogenici (DYS-HAC2). Dal trasferimento del DYS-HAC2 sono stati ottenuti cloni in cui la presenza dell’HAC è stata confermata sia per PCR sia per FISH. Al momento stiamo testando la reversibilità dell’immortalizzazione, tramite l’utilizzo di un lentivirus non integrante esprimente la Cre ricombinasi, e la potenzialità di tali cloni di colonizzare il muscolo scheletrico distrofico formando fibre esprimenti la distrofina