A stepwise study of vesicles with different morphology and lipid composition was performed through high-sensitivity differential scanning calorimetry at physiological pH with the purpose of comprehending the role played by some of the main factors that contribute to the thermodynamic stability of cell membranes, achieving the preparation of artificial lipid vesicles that highly resembled the phospholipid bilayer of Insulin Secretory Granules (ISGs), vesicles located in the pancreatic Langerhans β-cells and which are responsible for insulin and amylin storage and secretion in response to nutrient intake. All the considered vesicle preparations were aimed at representing only the lipid component of ISGs membrane, i.e. the phospholipid bilayer, but we will refer to all as “model membranes” in this thesis for simplicity’ sake. Curvature effects were considered by analysing the micro-DSC profiles of small, large and giant unilamellar vesicles prepared as pure and mixed systems of DMPC, DPPC, DSPC. The cross-study of binary systems composed by DMPC, DPPC, DSPC and DPPC, DPPS, DPPE allowed the dissection of the role played by several phospholipid headgroups and tails on the thermotropic behaviour of cell membranes, whilst the addition of DOPC, an unsaturated phospholipid, to a completely saturated ternary membrane characterized by only a specific phospholipid headgroup (choline) revealed the strong influence of unsaturated tails on membrane lipid organization. Therefore, a hierarchy of contribution to the overall thermodynamic stability of membranes was depicted as membrane curvature < phospholipid headgroup < phospholipid tail < phospholipid unsaturation. The following inclusion of sphingomyelins and lysophosphatidylcholines to a DPPC:DPPE:DPPS ternary membrane, whose composition already reflected the proportions in ISGs, together with a more complete fatty acids distribution characterizing the phospholipid bilayer of the ISGs allowed us to achieve the preparation of a high-complexity fourteen-components model membrane that reflected the 80% of phospholipids present in such a real system. The inclusion of cholesterol was finally considered for the achievement of the final ISG-like membrane. Furthermore, the effect of Free Fatty Acids (FFAs), whose levels are recurrently altered in diabetic and/or obese subjects, on the thermodynamic stability of selected membranes was investigated. The results highlighted strong stabilizing effects on the membranes as well as pronounced phase segregations in the case of saturated acids (palmitic and stearic acids), moderate stabilizing effects for a trans-unsaturated FFA (elaidic acid), whereas the opposite effect was observed in the case of a cis-unsaturated one (oleic acid). Finally, in order to investigate the interaction between model membranes and a pore-forming peptide (nisin), calorimetric and spectroscopic measurements were carried out. With this purpose, a simplified model membrane that resembled the thermodynamics of the ISG-like membrane was modelled by combining specific percentages of DMPC, DPPS and DOPC. Nisin-membrane interaction was studied on the simplified membrane through micro-DSC, fluorescence anisotropy and DLS at physiological pH, also highlighting the role of six different FFAs on peptide-membrane interaction, namely two saturated FFAs (palmitic and stearic acids), two monounsaturated FFAs (the cis-unsaturated oleic acid and the trans-unsaturated elaidic acid) and two polyunsaturated FFAs (the ω-6 linoleic acid and the ω-3 docosahexaenoic acid or DHA).

Allo scopo di comprendere il ruolo giocato da alcuni dei principali fattori che contribuiscono alla stabilità termodinamica delle membrane cellulari, è stato effettuato uno studio progressivo di vescicole con diversa morfologia e composizione lipidica a pH fisiologico mediante calorimetria a scansione differenziale ad alta sensibilità (High-Sensitivity DSC), raggiungendo la preparazione di vescicole lipidiche artificiali che rappresentano abbondantemente il doppio strato fosfolipidico dei granuli secretori di insulina (ISGs), vescicole presenti nelle cellule β di Langerhans del pancreas e addette alla conservazione e cosecrezione di insulina e amilina in seguito al consumo di alimenti. Tutte le vescicole sono state preparate allo scopo di rappresentare solamente la componente lipidica delle membrane delle ISGs, ovvero il bilayer fosfolipidico, ma per motivi di semplicità saranno tutte indicate come “membrane modello” in questa tesi. Gli effetti della curvatura di membrana sono stati considerati analizzando i profili micro-DSC di vescicole unilamellari piccole, grandi e giganti preparate come sistemi puri e misti di DMPC, DPPC e DSPC. Lo studio incrociato di sistemi binari composti da DMPC, DPPC, DSPC e DPPC, DPPS, DPPE ha consentito la discriminazione dei ruoli giocati dalle diverse teste e code fosfolipidiche riguardo al comportamento termotropico delle membrane cellulari, mentre l’aggiunta di DOPC, un fosfolipide insaturo, ad una membrane ternaria completamente satura e caratterizzata da solo una specifica testa fosfolipidica (colina) ha rivelato la forte influenza che le code insature hanno sull’organizzazione dei lipidi in membrana. Quindi, è stato possibile delineare una gerarchia di contributi alla stabilità complessiva delle membrane: curvatura di membrana < testa fosfolipidica < coda fosfolipidica < insaturazione fosfolipidica. La successiva inclusione di sfingomieline e lisofosfatidilcoline alla membrana ternaria DPPC:DPPE:DPPS, la cui composizione rifletteva già le proporzioni delle ISGs, insieme ad una distribuzione più completa di acidi grassi presenti nel bilayer fosfolipidico delle ISGs ha permesso di giungere alla preparazione di una membrana modello complessa costituita da quattordici componenti che riflette l’80% dei fosfolipidi presenti nel sistema reale. Infine, è stata considerata anche l’inclusione del colesterolo portando all’ottenimento della membrana simil-ISG finale. L’effetto di acidi grassi liberi (FFAs), i cui livelli sono spesso elevati in soggetti diabetici e/o obesi, sulla stabilità termodinamica di membrane selezionate è stato inoltre investigato. I risultati hanno evidenziato forti effetti stabilizzanti sulle membrane e pronunciate segregazioni di fase nel caso di acidi saturi (acidi palmitico e stearico), moderati effetti stabilizzanti per un acido insaturo trans (acido elaidico), mentre effetti opposti sono stati riscontrati per un acido insaturo cis (acido oleico). Infine, sono state effettuate misure calorimetriche e spettroscopiche allo scopo di investigare l’interazione tra membrane modello e un peptide in grado di formare pori (nisina). A tale scopo, è stata progettata una membrana modello semplificata rappresentante la termodinamica della membrana simil-ISG combinando specifiche percentuali di DMPC, DPPS e DOPC. L’interazione nisina-membrana è stata studiata sulla membrana semplificata mediante micro-DSC, anisotropia di fluorescenza e DLS a pH fisiologico, evidenziando inoltre il ruolo di sei diversi FFAs sull’interazione peptide-membrana, ossia due FFAs saturi (acidi palmitico e stearico), due monoinsaturi (acido oleico come acido insaturo cis e acido elaidico come acido insaturo trans) e due acidi grassi polinsaturi (l’acido linoleico come ω-6 e l’acido docosaesaenoico o DHA come ω-3).

THERMODYNAMIC STABILITY OF ISG-LIKE MODEL LIPID MEMBRANES: INSPECTING THE CONTRIBUTIONS OF LIPID-LIPID INTERACTION AND ACTION OF FREE FATTY ACIDS IN THE FRAME OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS DISEASE / F. Saitta ; tutor: D. Fessas ; dean: A. Pagliarini. DIPARTIMENTO DI SCIENZE PER GLI ALIMENTI, LA NUTRIZIONE E L'AMBIENTE, 2019 Dec 06. 32. ciclo, Anno Accademico 2019. [10.13130/saitta-francesca_phd2019-12-06].

THERMODYNAMIC STABILITY OF ISG-LIKE MODEL LIPID MEMBRANES: INSPECTING THE CONTRIBUTIONS OF LIPID-LIPID INTERACTION AND ACTION OF FREE FATTY ACIDS IN THE FRAME OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS DISEASE

F. Saitta
2019

Abstract

A stepwise study of vesicles with different morphology and lipid composition was performed through high-sensitivity differential scanning calorimetry at physiological pH with the purpose of comprehending the role played by some of the main factors that contribute to the thermodynamic stability of cell membranes, achieving the preparation of artificial lipid vesicles that highly resembled the phospholipid bilayer of Insulin Secretory Granules (ISGs), vesicles located in the pancreatic Langerhans β-cells and which are responsible for insulin and amylin storage and secretion in response to nutrient intake. All the considered vesicle preparations were aimed at representing only the lipid component of ISGs membrane, i.e. the phospholipid bilayer, but we will refer to all as “model membranes” in this thesis for simplicity’ sake. Curvature effects were considered by analysing the micro-DSC profiles of small, large and giant unilamellar vesicles prepared as pure and mixed systems of DMPC, DPPC, DSPC. The cross-study of binary systems composed by DMPC, DPPC, DSPC and DPPC, DPPS, DPPE allowed the dissection of the role played by several phospholipid headgroups and tails on the thermotropic behaviour of cell membranes, whilst the addition of DOPC, an unsaturated phospholipid, to a completely saturated ternary membrane characterized by only a specific phospholipid headgroup (choline) revealed the strong influence of unsaturated tails on membrane lipid organization. Therefore, a hierarchy of contribution to the overall thermodynamic stability of membranes was depicted as membrane curvature < phospholipid headgroup < phospholipid tail < phospholipid unsaturation. The following inclusion of sphingomyelins and lysophosphatidylcholines to a DPPC:DPPE:DPPS ternary membrane, whose composition already reflected the proportions in ISGs, together with a more complete fatty acids distribution characterizing the phospholipid bilayer of the ISGs allowed us to achieve the preparation of a high-complexity fourteen-components model membrane that reflected the 80% of phospholipids present in such a real system. The inclusion of cholesterol was finally considered for the achievement of the final ISG-like membrane. Furthermore, the effect of Free Fatty Acids (FFAs), whose levels are recurrently altered in diabetic and/or obese subjects, on the thermodynamic stability of selected membranes was investigated. The results highlighted strong stabilizing effects on the membranes as well as pronounced phase segregations in the case of saturated acids (palmitic and stearic acids), moderate stabilizing effects for a trans-unsaturated FFA (elaidic acid), whereas the opposite effect was observed in the case of a cis-unsaturated one (oleic acid). Finally, in order to investigate the interaction between model membranes and a pore-forming peptide (nisin), calorimetric and spectroscopic measurements were carried out. With this purpose, a simplified model membrane that resembled the thermodynamics of the ISG-like membrane was modelled by combining specific percentages of DMPC, DPPS and DOPC. Nisin-membrane interaction was studied on the simplified membrane through micro-DSC, fluorescence anisotropy and DLS at physiological pH, also highlighting the role of six different FFAs on peptide-membrane interaction, namely two saturated FFAs (palmitic and stearic acids), two monounsaturated FFAs (the cis-unsaturated oleic acid and the trans-unsaturated elaidic acid) and two polyunsaturated FFAs (the ω-6 linoleic acid and the ω-3 docosahexaenoic acid or DHA).
6-dic-2019
Allo scopo di comprendere il ruolo giocato da alcuni dei principali fattori che contribuiscono alla stabilità termodinamica delle membrane cellulari, è stato effettuato uno studio progressivo di vescicole con diversa morfologia e composizione lipidica a pH fisiologico mediante calorimetria a scansione differenziale ad alta sensibilità (High-Sensitivity DSC), raggiungendo la preparazione di vescicole lipidiche artificiali che rappresentano abbondantemente il doppio strato fosfolipidico dei granuli secretori di insulina (ISGs), vescicole presenti nelle cellule β di Langerhans del pancreas e addette alla conservazione e cosecrezione di insulina e amilina in seguito al consumo di alimenti. Tutte le vescicole sono state preparate allo scopo di rappresentare solamente la componente lipidica delle membrane delle ISGs, ovvero il bilayer fosfolipidico, ma per motivi di semplicità saranno tutte indicate come “membrane modello” in questa tesi. Gli effetti della curvatura di membrana sono stati considerati analizzando i profili micro-DSC di vescicole unilamellari piccole, grandi e giganti preparate come sistemi puri e misti di DMPC, DPPC e DSPC. Lo studio incrociato di sistemi binari composti da DMPC, DPPC, DSPC e DPPC, DPPS, DPPE ha consentito la discriminazione dei ruoli giocati dalle diverse teste e code fosfolipidiche riguardo al comportamento termotropico delle membrane cellulari, mentre l’aggiunta di DOPC, un fosfolipide insaturo, ad una membrane ternaria completamente satura e caratterizzata da solo una specifica testa fosfolipidica (colina) ha rivelato la forte influenza che le code insature hanno sull’organizzazione dei lipidi in membrana. Quindi, è stato possibile delineare una gerarchia di contributi alla stabilità complessiva delle membrane: curvatura di membrana &lt; testa fosfolipidica &lt; coda fosfolipidica &lt; insaturazione fosfolipidica. La successiva inclusione di sfingomieline e lisofosfatidilcoline alla membrana ternaria DPPC:DPPE:DPPS, la cui composizione rifletteva già le proporzioni delle ISGs, insieme ad una distribuzione più completa di acidi grassi presenti nel bilayer fosfolipidico delle ISGs ha permesso di giungere alla preparazione di una membrana modello complessa costituita da quattordici componenti che riflette l’80% dei fosfolipidi presenti nel sistema reale. Infine, è stata considerata anche l’inclusione del colesterolo portando all’ottenimento della membrana simil-ISG finale. L’effetto di acidi grassi liberi (FFAs), i cui livelli sono spesso elevati in soggetti diabetici e/o obesi, sulla stabilità termodinamica di membrane selezionate è stato inoltre investigato. I risultati hanno evidenziato forti effetti stabilizzanti sulle membrane e pronunciate segregazioni di fase nel caso di acidi saturi (acidi palmitico e stearico), moderati effetti stabilizzanti per un acido insaturo trans (acido elaidico), mentre effetti opposti sono stati riscontrati per un acido insaturo cis (acido oleico). Infine, sono state effettuate misure calorimetriche e spettroscopiche allo scopo di investigare l’interazione tra membrane modello e un peptide in grado di formare pori (nisina). A tale scopo, è stata progettata una membrana modello semplificata rappresentante la termodinamica della membrana simil-ISG combinando specifiche percentuali di DMPC, DPPS e DOPC. L’interazione nisina-membrana è stata studiata sulla membrana semplificata mediante micro-DSC, anisotropia di fluorescenza e DLS a pH fisiologico, evidenziando inoltre il ruolo di sei diversi FFAs sull’interazione peptide-membrana, ossia due FFAs saturi (acidi palmitico e stearico), due monoinsaturi (acido oleico come acido insaturo cis e acido elaidico come acido insaturo trans) e due acidi grassi polinsaturi (l’acido linoleico come ω-6 e l’acido docosaesaenoico o DHA come ω-3).
Settore CHIM/02 - Chimica Fisica
model lipid membranes; differential scanning calorimetry; thermodynamics; food; free fatty acids; insulin secretory granules; type 2 diabetes mellitus
FESSAS, DIMITRIOS
PAGLIARINI, ANTONELLA
Doctoral Thesis
THERMODYNAMIC STABILITY OF ISG-LIKE MODEL LIPID MEMBRANES: INSPECTING THE CONTRIBUTIONS OF LIPID-LIPID INTERACTION AND ACTION OF FREE FATTY ACIDS IN THE FRAME OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS DISEASE / F. Saitta ; tutor: D. Fessas ; dean: A. Pagliarini. DIPARTIMENTO DI SCIENZE PER GLI ALIMENTI, LA NUTRIZIONE E L'AMBIENTE, 2019 Dec 06. 32. ciclo, Anno Accademico 2019. [10.13130/saitta-francesca_phd2019-12-06].
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Descrizione: Tesi di dottorato - Francesca Saitta
Tipologia: Tesi di dottorato completa
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