DYSREGULATION OF INTESTINAL STEM CELLS IN CROHN'S DISEASE

Abstract Introduction. Several potential key factors, such as immune events, toxic environmental agents, genetic predisposition and abnormal microbiota have been established to play a role in the development of Crohn’s disease, but the mechanism behind it is still under investigation. Intestinal mucosa homeostasis relies on a delicate balance between self-renewal and differentiation, which is guaranteed by intestinal stem cells turnover within the local crypts. Recent studies suggested that an impaired differentiation of intestinal stem cells (ISCs) may facilitate the onset of Crohn’s disease via formation of a defective antimicrobial barrier, which enables intestinal bacteria to cause inflammation. The aim of our study is to explore whether ISCs are disrupted and their regenerative properties are altered in Crohn’s disease, thus representing a novel player in the disease onset and a potential therapeutic target to restore intestinal mucosa self-renewal abilities. Methods. A transcriptome analysis has been conducted on intestinal samples (both marginal and inflamed area with respect of the disease location) obtained from patients with and without Crohn’s disease to assess the expression of ISC markers. ISC regenerative properties have been tested by taking advantage of the mini-guts assay, where purified crypts were cultured as tridimensional organoids and their morphology/development were evaluated. Finally, mini-guts were grown from healthy subjects in serum of patients with Crohn’s disease to prove whether circulating factors/cytokines may exert a significant effect in abrogating organoids development and affect the expression of ISC markers. Results. ISC markers, particularly LGR5 and EPHB2, are poorly expressed in crypts isolated from intestinal samples of patients with Crohn’s disease. Interestingly, ISC markers are more preserved in the healthy zone, while their expression is nearly absent in the inflamed area. More importantly, ISC capability of self-renew tested in the mini-guts assay, was significantly abrogated in patients with Crohn’s disease, with only 40% of mini-guts developing from crypts obtained from the marginal area and less than 5% from those isolated from the inflamed portion of the intestinal sample. When cultured in the presence of serum of Crohn’s disease patients, mini-guts obtained from crypts of controls failed to generate normal self-renewed organoids and showed a reduced expression of EPHB2 and LGR5 ISC markers. Conclusion. We have demonstrated that the ISCs pool is reduced in Crohn’s disease and this is associated with a loss of regenerative properties of ISCs within the local crypts. When cultured in vitro with serum of patients with Crohn’s disease, mini-guts growth is fully abrogated thus suggesting that a defect in ISCs pool and function exist in the context of Crohn’s disease.

Riassunto Introduzione. Numerosi fattori, tra cui eventi immunitari, agenti ambientali tossici, predisposizione genetica e microbiota anormale svolgono un ruolo chiave nella patogenesi della malattia di Crohn, ma il principale meccanismo alla base è ancora oggetto di studio. L'omeostasi della mucosa intestinale si basa su un delicato equilibrio tra auto-rinnovamento e differenziazione, che è garantita dal ricambio delle cellule staminali intestinali all'interno delle cripte. Recenti studi suggeriscono che una differenziazione alterata delle cellule staminali intestinali (ISC) può facilitare l'insorgenza della malattia di Crohn attraverso la formazione di una barriera antimicrobica difettosa, che consente ai batteri intestinali di provocare l'infiammazione. Lo scopo del nostro studio è quello di esplorare se le ISC sono danneggiate e le loro proprietà rigenerative sono alterate nella malattia di Crohn, rappresentando così un nuovo attore nell'insorgenza della malattia e un potenziale bersaglio terapeutico per ripristinare le capacità di auto-rinnovamento della mucosa intestinale. Metodi. Su campioni intestinali (sia area marginale che infiammata rispetto alla sede della malattia) ottenuti da pazienti con e senza malattia di Crohn è stata condotta un’analisi del trascrittoma per valutare l'espressione dei marcatori per ISC. Le proprietà rigenerative delle ISC sono state studiate utilizzando il test del mini-guts, in cui le cripte purificate sono state coltivate come organoidi tridimensionali e la loro morfologia / sviluppo sono stati valutati. Infine, mini-guts sono stati coltivati a partire dalle cripte di soggetti sani con siero di pazienti affetti da malattia di Crohn per dimostrare se i fattori circolanti / citochine potessero esercitare un effetto significativo nell'abrogazione dello sviluppo di organoidi e influenzare l'espressione dei marcatori per ISC. Risultati. I marcatori per ISC, in particolare LGR5 e EPHB2, sono scarsamente espressi in cripte isolate da campioni intestinali di pazienti con malattia di Crohn. È interessante notare che i marcatori per ISC sono più preservati nella zona sana, mentre la loro espressione è quasi assente nell'area infiammata. Ancora più importante, la capacità delle ISC di auto-rinnovamento testata nel saggio mini-guts, è stata trovata significativamente ridotta nei pazienti con malattia di Crohn, con solo il 40% dei mini-guts che si sviluppano da cripte ottenute dall'area marginale e meno del 5% da quelle isolate dalla parte infiammata del campione intestinale. Quando i mini-guts ottenuti dalle cripte dei controlli sono stati coltivati in presenza di siero di pazienti affetti da malattia di Crohn non riuscivano a generare organoidi normali e mostravano una ridotta espressione dei marcatori per ISC EPHB2 e LGR5. Conclusione. Abbiamo dimostrato che il pool delle ISC è ridotto nella malattia di Crohn e che questo si associa a una perdita di proprietà rigenerative delle ISC all'interno delle cripte. La crescita di mini-gut in vitro in presenza del siero di pazienti affetti da morbo di Crohn, è quasi completamente annullata, suggerendo quindi che nel contesto della malattia di Crohn esiste un difetto del pool e della funzione rigenerativa delle ISC.