Caratterizzazione lipidica e proteica di membrane post-sinaptiche

INTRODUZIONE E SCOPO DELLA RICERCA Gli sfingolipidi hanno un importante ruolo a livello cerebrale poichè modificano la struttura, la fluidità e le funzioni delle membrane cerebrali. Sono localizzati in particolare sul foglietto esterno della membrana plasmatica con la catena oligosaccaridica esposta sulla superficie cellulare, in contatto con l’ambiente esterno, e con la porzione ceramidica inserita nel bilayer della membrana, insieme ad altri lipidi e proteine. Questa peculiarità permette agli sfingolipidi di giocare un ruolo molto importante nei processi di trasduzione del segnale. Questi infatti sono in grado di modulare l’attività di molte proteine di membrana, inclusi enzimi, canali ionici e recettori per ligandi extracellulari. Tali attività sono state accuratamente studiate in relazione ai glicosfingolipidi, ed in particolare per quanto riguarda i gangliosidi. I gangliosidi, con la loro eterogenea porzione oligosaccaridica, costituiscono il sito di riconoscimento sulla superficie cellulare ed interagiscono con una moltitudine di molecole extracellulari. [1, 2]. Nelle sinapsi, il complesso delle giunzioni sinaptiche con le membrane post-sinaptiche sembra contenere proteine responsabili per l’adesione tra membrane pre- e post- sinaptiche e per la traduzione del segnale postsinaptico. [3]. Quindi, abbiamo messo a punto una procedura per isolare le membrane plasmatiche post-sinaptiche da neuroni di cervelletto di ratto, in modo tale da studiare l’arricchimento in sfingolipidi e la possibile interazione tra gangliosidi e proteine. APPROCCI SPERIMENTALI E RISULTATI Come modello cellulare abbiamo utilizzato cellule granulari di ratto differenziate in cultura. L’esperimento è stato condotto il 14° giorno di cultura poichè a questo stadio i livelli di PSD-95, la principale proteina delle PSD, sono massimi. Per studiare l’arricchimento lipidico delle frazioni postsinaptiche gli sfingolipidi delle cellule sono stati marcati metabolicamente usando come precursore sfingsina radioattiva. Parallelamente, le proteine di superficie sono state biotinilate in modo tale da poter monitorare la presenza delle proteine durante ciascun passaggio dell’isolamento. Le membrane plasmatiche sono state isolate mediante subfrazionamento su gradiente discontinuo di saccarosio e successivamente le membrane postsinaptiche sono state separate dalle presinaptiche mediante shock litico [4, 5]. La presenza delle proteine è stata valutata durante ciascun passaggio della procedura sperimantale mediante il dosaggio proteico DC assay e successivamente mediante dot blot usando anticorpi a-PSD 95 ed a-biotina; parallelamente abbiamo seguito la radioattività associata agli sfingolipidi nel corso dell’isolamento. La composizione lipidica delle frazioni ottenute è stata analizzata mediante cromatografia su strato sottile ad alta risoluzione, in modo tale da verificare se potesse essere presente un arricchimento lipidico a livello di queste strutture. REFERENCES 1. Prinetti, A., Chigorno, V., Prioni, S., Loberto, N., Marano, N., Tettamanti, G., and Sonnino, S.: Changes in the lipid turnover, composition, and organization, as sphingolipid-enriched membrane domains, in rat cerebellar granule cells developing in vitro. J Biol Chem, 276, 21136-45 (2001) 2. Cohen, A.W., Hnasko, R., Schubert, W., and Lisanti, M.P.: Role of caveolae and caveolins in health and disease. Physiol Rev, 84, 1341-79 (2004) 3. Cho, K.O., Hunt, C.A., and Kennedy, M.B.: The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron, 9, 929-42 (1992) 4. Gurd, J.W., Jones, L.R., Mahler, H.R., and Moore, W.J.: Isolation and partial characterization of rat brain synaptic plasma membranes. J Neurochem, 22, 281-90 (1974) 5. Ehlers, M.D.: Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci, 6, 231-42 (2003)