Studio della biogenesi della proteina tail-anchored VAP-B e di una sua forma mutata associata alla sclerosi lateale amiotrofica

Le proteine tail-anchored (TA) sono una classe di proteine transmembrana caratterizzate da un dominio citosolico N-terminale e un singolo dominio transmembrana al C-terminale. A causa della loro particolare topologia, le TA non seguono il sistema co-traduzionale SRP/Sec61-dipendente per inserirsi nella membrana del reticolo endoplasmatico (ER), ma un meccanismo post-traduzionale di cui molti aspetti sono ancora da caratterizzare. Recentemente è stato dimostrato che esistono due vie di inserzione per queste proteine: una, chiamata assistita, che necessita di chaperone, ATP e un recettore di membrana, e una chiamata non assistita , attraverso la quale alcune proteine TA possono inserirsi spontaneamente nel doppio strato lipidico. In questo mio primo anno di Dottorato ho studiato la biogenesi di VAP-B, una proteina TA residente dell'ER, e della sua forma mutata VAP-B P56S, che studi recenti riportano essere associata a una forma di sclerosi laterale amiotrofica a insorgenza tardiva chiamata ALS8 (Nishimura et al., 2004). Per determinare se VAP-B è una TA che si inserisce nella membrana dell’ER in maniera non assistita oppure in maniera assistita, ho utilizzato il saggio di protezione da proteasi messo a punto nel nostro laboratorio (Brambillasca et al., 2005; Brambillasca et al., 2006). I risultati hanno dimostrato che VAP-B si inserisce nell'ER in modo assistito: la proteina infatti trasloca in microsomi ma non in vescicole di soli lipidi. La traslocazione risulta inoltre inefficiente, se confrontata con altre TA studiate nel laboratorio, quali il citocromo b5 (b5) (Brambillasca et al., 2005). Ho studiato quindi se è il transmembrana (TM) di VAP-B a giocare un ruolo nel determinare la bassa efficienza di traslocazione. Ho sostituito quindi vicendevolmente i TM di VAP-B e del b5, creando le due proteine chimeriche b5 TM VAP-B e VAP-B TM b5. Come atteso, ho osservato un miglioramento nella traslocazione della chimera VAP-B TM b5 e un peggioramento per la chimera b5 TM VAP-B; questo indica quindi che il TM di VAP-B è molto importante nel determinare la sua bassa efficienza di inserimento nell’ER. Dato che VAP-B possiede due sequenze di dimerizzazione, una all'interno del dominio TM e l'altra immediatamente a monte di quest'ultimo, ho studiato se la bassa efficienza di traslocazione della proteina può essere determinata anche da previa aggregazione per via delle due sequenze. Mutandole, tuttavia, non si osserva alcun miglioramento nella traslocazione di VAP-B. Passando quindi allo studio della biogenesi di VAP-B P56S, non ho notato alcuna differenza rilevante nel comportamento di traslocazione della proteina rispetto al wild-type; questo significa che la proteina mutata non provoca alcuna anomalia nell’inserzione nella membrana dell’ER di VAP-B. Tuttavia, overesprimendo per 24 ore VAP-B P56S in cellule CV1 si osservano grossi aggregati di proteina, al contrario di quello che si osserva per la forma wild-type che si distribuisce diffusamente nell'ER. Ho notato inoltre che in alcune cellule, a fasi precoci dell'espressione, VAP-B P56S é diffusa nell'ER analogamente al wild-type; si suppone quindi che la formazione di aggregati avvenga solo in fasi successive alla normale inserzione della proteina nella membrana dell’ER, confermando quindi i dati già ottenuti nei saggi in vitro. Per quanto riguarda la caratterizzazione degli aggregati, si osserva che essi colocalizzano con il marker generale dell'ER mVENUS-ER e con il marker del lume dell'ER PDI; sezioni sull'asse z mostrano inoltre come la colocalizzazione tra gli aggregati e la PDI si estende per tutta l'altezza dell'aggregato. Non si osserva invece colocalizzazione con il marker dell'ER rugoso Sec61β, con il marker del Golgi giantina e con il colorante acidofilo Lyso-tracker, marker della via endo-lisosomiale. In conclusione, nel mio primo anno di Dottorato ho osservato che la TA VAP-B si inserisce con un meccanismo di tipo assistito nella membrana dell'ER, ma poco efficientemente. La bassa efficienza di traslocazione può essere ricondotta al tipo di dominio TM che la proteina possiede, ma non ad aggregazione antecedente l'inserzione in membrana. VAP-B P56S nei primi stadi della sua biogenesi si comporta allo stesso modo della forma wild-type, ma in fasi successive forma aggregati che sembrano originare dall'ER, presumibilmente dall'ER liscio.