Il tessuto adiposo fonte di cellule progenitrici per medicina rigenerativa : studio in vitro del potenziale osteogenico e condrogenico e possibili applicazioni cliniche

L’ingegneria tissutale è un’emergente disciplina che raccoglie ed integra competenze mediche, biologiche e ingegneristiche. Uno dei suoi scopi è la rigenerazione o la sostituzione dei tessuti biologici danneggiati da patologie o traumi, che viene raggiunto creando dei dispositivi bioingegnerizzati, chirurgicamente impiantabili, integrando cellule, scaffold biocompatibili e fattori bioattivi (quali farmaci, citochine e fattori di crescita) in grado di promuovere la rigenerazione garantendo l’integrazione con i tessuti ospiti circostanti. Questa tecnologia trova grande applicazione in numerosi ambiti clinici come la dermatologia, la chirurgia plastica ricostruttiva, la chirurgia oro-maxillo-facciale e l’ortopedia. La cellula ideale richiesta per l’ingegneria tissutale deve mostrare un buon potenziale autorigenerativo, la capacità di sostituire funzionalmente il tessuto danneggiato e deve essere presente con una disponibilità piuttosto elevata, in quanto potrebbe essere necessario intervenire su difetti molto estesi. Le cellule staminali mesenchimali (MSC, Mesenchymal Stem Cells), oggi coinvolte in molte tecniche di medicina rigenerativa, sono presenti nel midollo osseo e in altri tessuti adulti. Esse sono in grado di differenziare, se stimolate opportunamente, in cellule appartenenti alla linea mesenchimale quali osso, cartilagine, tessuto adiposo e muscoli. Attualmente il midollo osseo è la fonte più comunemente utilizzata per l’isolamento delle MSC (BMSC, Bone Marrow Stromal Cells), ma presenta alcune limitazioni quali la necessità dell’anestesia generale durante il prelievo, la sensazione dolorosa avvertita dal paziente nel post-operatorio e la scarsa resa cellulare. Una fonte alternativa di MSC è stata individuata nel tessuto adiposo sottocutaneo, prelevabile mediante semplici interventi di liposuzione; i vantaggi dell’utilizzo di questo tessuto, normalmente considerato di scarto, sono il prelievo in anestesia locale, e la possibilità di ottenere grandi quantità di tessuto e, di conseguenza, un elevato numero di cellule. Lo scopo del nostro studio è stato quello di valutare l’idoneità del tessuto adiposo umano come fonte di cellule staminali mesenchimali, analizzando dapprima le caratteristiche delle hASC (human Adipose-derived Stem Cells) allo stato indifferenziato e successivamente inducendo il differenziamento delle hASC verso la linea condrogenica, osteogenica ed adipogenica per una futura applicazione clinica. In questo studio in vitro sono state analizzate cellule hASC (human Adipose derived Stem Cells) isolate da tessuto adiposo sottocutaneo prelevato mediante liposuzione da 23 pazienti, di età compresa fra i 20 e i 60 anni (4 uomini e 19 donne, età media: 38 ± 11 anni), opportunamente informati e che hanno sottoscritto il consenso all’utilizzo di tale materiale biologico per sperimentazioni di base. I campioni di tessuto, in quantità variabile fra i 20 e i 250 ml per ciascun donatore, e provenienti da differenti distretti corporei (addome - glutei – coscia - ginocchio), sono stati processati mediante digestione enzimatica con collagenasi di tipo I ottenendo una “Stromal Vascular Fraction” (SVF) dalla quale le hASC sono state separate adesione per aderenza. La resa cellulare, dopo la digestione e prima della semina, è stata di 4,3X105 cellule/ml di tessuto adiposo digerito, con una variabilità piuttosto elevata, ma non correlata all’età del donatore. Dopo circa 10 giorni dall’isolamento le hASC appaiono una popolazione omogenea di tipica forma fibroblastoide, che viene mantenuta oltre il XIV passaggio in coltura. Dopo circa una settimana di “latenza” post isolamento, le hASC, seminate ad una densità di 104 cellule per cm2, hanno cominciato a duplicare rapidamente raggiungendo una confluenza dell’80-90% ogni 2 -3 giorni. La capacità clonogenica delle hASC è stata valutata utilizzando il saggio CFU-F (Fibroblast - Colony Forming Unit) dal quale emerge che il potenziale clonogenico si riduce gradualmente in relazione al periodo di mantenimento in coltura, con una percentuale di precursori clonogenici compresa fra il 10% e il 20% al I o II passaggio, e di circa il 3% al VII e VIII passaggio. Le cellule hASC sono state quindi caratterizzate immunofenotipicamente mediante analisi citofluorimetrica, valutando l’espressione di marcatori specifici delle cellule staminali mesenchimali; oltre il 95% delle hASC esprimono elevati livelli di CD13, CD90 (Thy-1) e CD105/SH2 (Endoglin), circa il 90% sono CD44+, l’80% sono CD29+ e circa il 75% delle hASC esprimono il CD54 (ICAM-1), mentre il CD49d è presente in una percentuale che varia fra l’85% e il 30%. E’ stata inoltre osservata una scarsa espressione di CD14 (1%-9%) e l’assenza di CD45, CD71 e CD106. La valutazione citofluorimetrica ha inoltre permesso di valutare le dimensioni e la granulosità delle varie popolazioni confermandone l’omogeneità. E’ stata anche valutata l’espressione di alcuni marcatori precoci di staminalità all’esordio e ai primi passaggi in coltura: sorprendentemente il CD34 è risultato significativamente espresso in cellule appena isolate (20-60%) come anche il CD271 (p75 NGF receptor, NGFR), anche se in percentuale inferiore (10%-20%); l’espressione di CD34 si riduce poi significativamente in cellule in coltura passando a una positività del 10-30%, mentre CD271 passa a un 5-7% di cellule positive al III passaggio e scompare del tutto dal XIII passaggio. Sulla base di queste osservazioni sono attualmente in corso ulteriori studi caratterizzazione delle sottopopolazioni CD34+ e NGFR+. Il passo successivo è stato quello di determinare la potenzialità differenziativa delle hASC: cellule al IV passaggio allo stato indifferenziato al sono state indotte a differenziare, in presenza di specifici medium, verso la linea adipogenica, condrogenica o osteogenica. Le hASC differenziate verso la linea adipogenica presentano già dopo 7 giorni numerosi vacuoli che risultano ricchi di trigliceridi apolari. Il differenziamento condrogenico è stato indotto con cellule cresciute in 3D in “pellet culture”; dopo 21 giorni di differenziamento le hASC sono state in grado di depositare una matrice simil-cartilaginea ricca di glicosamminoglicani, con aumento significativo di deposizione di circa il 23% rispetto alle cellule mantenute in terreno non induttivo. Cellule hASC differenziate verso la linea osteogenica in due diversi terreni differenziativi, OM1 e OM2, a diversi tempi di coltura (14-21-28 giorni), sono invece state analizzate valutando la deposizione di calcio, l’attività di fosfatasi alcalina (ALP) e l’espressione intracellulare di Osteopontina (OPN), proteina tessuto-specifica. Le hASC coltivate in medium osteogenico, in particolare OM2, differenziano efficientemente rispetto alle hASC non trattate e, infatti già dopo 14 giorni di coltura si osserva un significativo aumento dell’attività fosfatasica e la comparsa di OPN. Inoltre le hASC cresciute in OM2 depositano abbondante calcio extracellulare, che, dopo 21 giorni, risulta di circa 2.5 volte superiore rispetto a quello determinato su cellule non differenziate. Poiché gli scaffold rivestono un ruolo fondamentale in alcune applicazioni di medicina rigenerativa, soprattutto in ambito ortopedico, dove, almeno inizialmente, devono fornire anche un supporto meccanico, abbiamo analizzato il comportamento delle hASC, sia indifferenziate, che già differenziate verso la linea osteogenica, a contatto con alcuni biomateriali utilizzati in campo ortopedico ed odontoiatrico. Le hASC sono state quindi seminate su idrossiapatite, osso bovino deproteinizzato, frammenti di osso umano spongioso di banca, viti di titanio, schiume di poliuretano e fibre di alginato di calcio, per determinare se questi potessero essere dei validi supporti per la crescita e il differenziamento delle hASC. Al microscopio elettronico a scansione (SEM) è stato osservato che le hASC hanno aderito stabilmente a tutti i materiali testati, seppur con qualche differenza dovute alle proprietà di superficie del materiale, e in nessun caso si sono verificati effetti di citotossicità riconducibili ai biomateriali. Le hASC seminate sugli scaffold porosi sono state in grado di produrre livelli di calcio superiori rispetto a quelli prodotti dalle cellule in monostrato, avvalorando l’ipotesi dell’osteoconduttività degli scaffold testati. Infine, non avendo riscontrato differenze in termini di adesione o di potenziale differenziativo tra hASC indifferenziate seminate sugli scaffold e cellule hASC precedentemente differenziate e poi seminate in, si può considerare la possibilità di utilizzare nella pratica clinica in un unico step chirurgico alcuni costrutti hASC-scaffold subito dopo il prelievo e la purificazione. I nostri risultati confermano l’ipotesi che il tessuto adiposo sottocutaneo contiene cellule multipotenti in grado di differenziare verso la linea osteogenica, condrogenica o adipogenica, e che quindi potrebbero essere utilizzate in medicina rigenerativa in alternativa alle cellule mesenchimali isolate da midollo. Il nostro studio proseguirà incentrando le ricerche sull’analisi in vitro delle hASC e dei fenomeni che regolano il differenziamento, e sulle applicazioni delle hASC in vivo in modelli animali, studiando in particolare le modalità di integrazione dei costrutti hASC-scaffold, selezionati in vitro, in particolari lesioni critiche osteocondrali in roditori e ovini.