Un passo verso la sicurezza : la UE approva il test GM-CFU

NOTA INFORMATIVA L’Unione europea approva nuove alternative alla sperimentazione di farmaci e sostanze chimiche sugli animali. Il 21 marzo 2006 il comitato scientifico consultivo del Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (ECVAM) ha approvato sei nuovi metodi di prova alternativi che consentiranno di ridurre il ricorso alla sperimentazione animale per alcuni farmaci e sostanze chimiche . I nuovi test, effettuati su colture cellulari anziché su animali, permettono di determinare la tossicità dei farmaci antitumorali e identificare i farmaci contaminati. Oltre a ridurre il numero di animali necessari ai fini della sperimentazione, i metodi approvati oggi miglioreranno l’accuratezza dei test e contribuiranno così a rendere i prodotti più sicuri. Uno dei test approvati è noto come Colony Forming Unit-Granulocytes-Macrophages (CFU-GM) ed è volto a render più preciso il dosaggio di alcuni farmaci ad elevata tossicità utilizzati nella chemioterapia per la cura del cancro. Il test validato è un cosiddetto test clonogenico basato sulla proliferazione/differenziazione "in vitro" di progenitori emopoietici ottenuto stimolando questi ultimi con determinate citochine in una coltura semisolida (generalmente di agar o di metilcellulosa). Molte modificazioni sono state proposte a partire dalla tecnica originale messa a punto da Bradley e Metcalf e sebbene molte di queste sono state usate in ematologia poche di loro sono state sviluppate in strumenti standardizzati e validati per studiarne la ematotossicità. Lo studio in questione ha quindi dovuto dapprima confrontarne la riproducibilità nelle specie murina ed umana applicata al midollo osseo, poi valutarne la possibilità di sostituire il midollo osseo con il sangue di cordone ombelicale ( più facilmente reperibile ) e successivamente studiare le condizioni ottimali (sia riguardo il terreno di coltura, le citochine ed altri reagenti essenziali) per applicare adeguatamente il test in studi di tossicologia dove l'attività del farmaco non deve subire fenomeni di detossificazione o comunque interferenze. Non è da sottovalutare che il test validato in vitro potrà contribuire anche a ridurre il numero di animali richiesti in tossicologia preclinica e in particolare il cane usato come seconda specie. Il lavoro di ottimizzazione prima e poi di prevalidazione (1) e di validazione (2) di questo test nella sua applicazione nel campo della ematotossicologia è stato eseguito da un gruppo di ricerca internazionale costituitosi nel 1996 e coordinato dal Dr Augusto Pessina (Responsabile del Laboratorio di Colture Cellulari della Sezione di Microbiologia del Dipartimento di Sanità Pubblica, Microbiologia, Virologia della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’ Università Statale di Milano). Il gruppo di ricercatori dell’Università di Milano, con il supporto del Consorzio Milano Ricerche ha realizzato il progetto in collaborazione con ECVAM, JRC( Ispra), e coordinando lo studio di altri quattro centri di ricerca: in Spagna (Cell Biology, Environment Institute, CIEMAT, Madrid); in Francia (Ecole Superieure de Microbiologie et Sècurité Alimentaire (ESMISAB), Universitè de Bretagne Occidentale, Plouzanè); in Belgio (Department of Environmental Toxicology, VITO-Flemish Institute for Technological Research, Mol ) e negli USA ( Laboratory of Pharmacology, Cancer Centre, Wayne State University, Detroit (MI)). La validazione del test è stato eseguita in “doppio cieco” avvalendosi di agenti esterni che hanno provveduto a fornire i farmaci codificati secondo criteri di GLP e sicurezza (BIBRA International, Carshalton, in Inghilterrra e Oncology Research and Regulatory Consulting Associates, Grosse Pointe Woods negli Stati Uniti) Il test è stato validato innanzitutto come strumento predittivo della neutropenia acuta in pazienti esposti a farmaci antitumorali e poichè utilizza colture di cellule da midollo osseo di topo e cellule da sangue di cordone ombelicale umano(che contiene cellule staminali e precursori delle cellule del sangue che rispondono in modo simile a quelli del midollo osseo). L'applicazione del test diminuisce il rischio di sovradosaggio letale che può verificarsi nel primo gruppo di pazienti trattati con nuovi farmaci antineoplastici, rischio che i test preclinici attuali non permettono di identificare con precisione. Questo nuovo test, rispetto alla sola sperimentazione animale , offre un maggior grado di precisione, poichè affina i margini di sicurezza riducendo l’incertezza dovuta alla estrapolazione animale/uomo e fornisce una base più razionale per determinare le dosi cliniche e valutare i limiti di esposizione umane definiti come massima dose tollerata (MDT). Infatti, la prima fase della sperimentazione farmacologia clinica ( cosiddetta di fase I ) ha come obiettivo quello di valutare la dose massima di farmaco tollerata nell’uomo e,per fare questo, il composto viene somministrato a volontari sani e maschi in quantità crescenti (dose escalation). In questo modo i calcoli dovrebbero essere resi più precisi e soprattutto meno pazienti dovrebbero correre il rischio di essere trattati con dosi di farmaco ad elevato rischio. E’ noto che proprio durante i trials clinici su pazienti il 30% dei farmaci fallisce a causa degli effetti tossici, nonostante siano stati eseguiti preventivamente tutti i tests tossicologici in animale e che , per i nuovi tipi di farmaci (proteine ricombinanti, anticorpi, ecc), che rappresentano oltre il 50 % nelle nuove notifiche, la tossicologia tradizionale non funziona bene o non funziona affatto. Questo test potrebbe quindi anche offrire un ulteriore strumento di indagine tossicologica. I risultati ottenuti con questo tests sono in conclusione, molto importanti per due fondamentali aspetti: - Uno più generale e cioè che le tecniche con colture cellulari in vitro possono essere utili nel valutare differenze di specie e che con modelli cellulari (per esempio murino e umano ) si può tentare di estrapolare dati su possibili effetti “in vivo” nella specie umana. - L’altro più diretto, che i tests in vitro come quello validato contribuiscono a migliorare il livello di sicurezza nei trials clinici di fase I. Ciò è di importanza critica soprattutto alla luce del recenti fatto di cronaca accaduto a Londra ( marzo 2006) circa il drammatico esito che ha avuto il trattamento di alcuni giovani con un nuovo farmaco in sperimentazione (TGN1412). Per comprenderne adeguatamente la portata è importante avere presente alcuni aspetti essenziali che si possono così riassumere: - Il rapido turnover delle cellule del sistema emopoietico deputato a mantenere l’omeostasi di tutto il sistema del sangue ma anche in notevole parte di quella immunologia lo rende un bersaglio molto sensibile ai fenomeni di tossicità che si esplica con diversi meccanismi sia verso cellule mature , che progenitori in rapida proliferazione e differenziazione . - Questi particolari effetti avversi dovuto alla assunzione di farmaci possono talvolta essere secondari a conseguenze di tossicità espressa per altri organi o sistemi. Se per certe terapie un tale effetto tossico è accettabile per ottenere benefici in altri casi è assolutamente intollerabile ed importante avere strumenti adeguati per poter predire fenomeni ematotossici quali i le gravi forme di mielosuppressione o granulocitopenia . Le agenzie regolatrici richiedono per i farmaci studi di tossicologia in vivo in almeno due specie animali (tra le quali un non-roditore, di solito il cane) e la potenziale ematotossicità viene basata su parametri di ematologia clinica monitorati nell’animale e sulla base di questi parametri ( severità della citopenia, tempi di esposizione grado di reversibilità ecc ) si tenta di predire quale possa essere la tossicità nella specie umana. Questi dati sperimentali sono ancora oggi il principale criterio usato per derivare la più alta dose da amministrare nella cosiddetta fase I di sperimentazione clinica fatta quindi direttamente nell’uomo. E’ quindi molto importante potere predire se un nuovo agente sarà clinicamente tossico sul midollo osseo umano e i tests in vitro possono contribuire proprio ad aumentare il grado di sicurezza riducendo soprattutto l’incertezza insita nella estrapolazione dall’animale di laboratorio alla specie umana. Va ricordato che la mielotossicità è una delle maggiori limitazioni all’uso di dosaggi pieni dei farmaci antineoplastici per i quali gli aspetti regolatori sottolineano l’imporrtanza di stabilire due fondamentali liveli di esposizione: la più elevata dose che non causa effetti avversi e quella che causa la massime perturbazioni tollerate nella conta del sangue periferico definita come MTD. Va ricordato che anche dopo lavvento dei bersagli molecolari nello sviluppo di nuovi approci terapeutici oltre il 50 % ( negli ultimi 15 anni) dei farmaci antitumorali trovano la loro dose tossica limitante dovuta alla mielosoppressione. L’industria farmaceutica ha già valutato l’utilità di questo test tanto che spesso, importanti decisioni circa la selezione di composti da sviluppare sono prese anche sulla base di dati forniti da questo test. Recenti pubblicazioni (3,4) hanno anche mostrato l’utilità di una versione miniaturizzata ( in piastre da 96 pozzetti) di questo test che è stato anche applicato per valutare predittivamente la sensibilità in vitro di precursori mieloidi umani e di topo verso 10 nuove molecole antitumorali della Cancer Research UK. Le curve dose-risposta ottenute avrebbero confermato una uguale predittività del test validato e quello miniaturizzato tanto da suggerire che il test miniaturizzato possa esser usato in high-throughput screening Bibliografia 1 Pessina, A., Albella, B., Bueren, J., Brantom, P., Casati, S., Gribaldo, L., Croera, C., Gagliardi, G., Foti, P., Parchment, R., Parent-Massin, D., Sibiril, Y., Schoeters, G. and Van Den Heuvel, R (2001) Prevalidation of a model for predicting acute neutropenia by Colony Forming Unit-Granulocyte/Macrophage (CFU-GM) assay. Toxicology in Vitro 15, 729-740. 2 Pessina A, Albella B, Bayo M, Bueren J, Brantom P, Casati S, Croera C, Gagliardi G, Foti P, Parchment R, Parent-Massin D, Schoeters G, Sibiril Y, Van Den Heuvel R, Gribaldo L. (2003) Application of the CFU-GM assay to predict acute drug-induced neutropenia: an international blind trial to validate a prediction model for the maximum tolerated dose (MTD) of myelosuppressive xenobiotics. Toxicological Sciences 75, 355-367. 3 Pessina A, Croera C, Bayo M, Malerba I, Passardi L, Cavicchini L,Neri MG, Gribaldo L.(2004) A methylcellulose microculture assay for the in vitro assessment of drug toxicity on granulocyte- macrophage progenitors (CFU-GM). ATLA 32,7-23. 4 Malerba I, Ferrario D,Farmer H,Gribaldo L,Casati S. (2006). Inhibition of GM-CFU colony growth by ten anticancer drugs assessed by a high-throughput clonogenic microtest. Comm. To 46th ETCS Meeting , March 26-29, Verona, Italy.