Analisi di 3 potenziali sorgenti cellulari per lo sviluppo di un sostituto biologico meniscale

Obiettivo. Il menisco svolge un ruolo di fondamentale importanza per la funzionalità del ginocchio ma, a causa dello scarso potenziale riparativo intrinseco, la riparazione e/o rigenerazione delle lesioni meniscali rappresenta uno degli obiettivi principali della terapia cellulare. Risulta pertanto determinante lo sviluppo ex vivo di supporti biocompatibili cellulati che mimino le caratteristiche morfologiche e funzionali del tessuto nativo. Fondamentale è dunque la scelta di una popolazione cellulare adeguata da indirizzare verso la linea meniscale mediante trattamento con fattori di crescita, e da utilizzare in associazione a opportuni scaffolds. Metodi. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono state isolate sia dal tessuto adiposo (ASCs, n=2) che dal midollo osseo (BMSCs, n=2). Contemporaneamente è stato anche valutato l’utilizzo di fibroblasti dermici (DFs, n=2). Le 3 popolazioni, derivate da pazienti sani, sono state caratterizzate per la loro capacità di automantenersi in coltura (proliferazione e clonogenicità), e per la loro capacità multidifferenziativa, sia verso la linea osteogenica, che verso la linea fibrocartilaginea tipica del tessuto meniscale. Due differenti medium fibrocondro-induttivi M1 (TGF-β3+BMP-2) e M2 (TGF-β1+BMP-7+IGF-1) sono stati utilizzati e analisi qualitative morfologiche (ematossilina/eosina, safranina-O) e quantitative biochimiche (glicosamminoglicani, GAGs) sono state effettuate. Risultati. In coltura, in condizioni di crescita standard, le 3 popolazioni hanno mostrato una morfologia simil-fibroblastoide e un tasso di crescita rapido e costante (54.7±14.3 ore per le ASCs, 69.0±7.6 ore per le BMSCs e 48.4±6.3 ore per i DFs). Inoltre, sia le MSCs che i DFs, hanno mostrato un elevato potenziale clonogenico (7.4±1.8%, 4.9±1.9% e 9.8±2.8% per le ASCs, BMSCs e i DFs, rispettivamente). In presenza di specifici stimoli osteo-induttivi, le MSCs, sia di origine adiposa che midollare, e i DFs, sono state in grado di differenziare verso cellule della linea osteogenica: un incremento statisticamente significativo nell’attività di fosfatasi alcalina è stato osservato nelle osteo-ASCs (+394.7%, p<.05) e nelle -BMSCs (+331.1%, p<.05) e, in misura minore, nei -DFs (p>.05). Ulteriore conferma della capacità differenziativa è stata dimostrata dalla capacità di cellule osteo-differenziate di produrre e depositare collagene (+232.8% per le ASCs, +87.4% per le BMSCs e 229.0% per i DFs) e matrice calcificata extracellulare (+749.0, +100.0 e +500.8% rispettivamente per le ASCs, BMSCs e DFs), rispetto alle cellule controllo. Le cellule sono state inoltre indotte a differenziare verso la linea fibrocartilaginea: i medium induttivi, e in particolare il medium M1, hanno indotto una modificazione della morfologia cellulare portando, in tutte le popolazioni cellulari, ad una parziale perdita della caratteristica forma fibroblastoide e all’assunzione una morfologia più cuboidale e voluminosa. Il differenziamento condrogenico è stato inoltre effettuato nella condizione “pellet culture” per 21 giorni, ricreando parzialmente la condizione fisiologica in vitro del tessuto meniscale: incrementi statisticamente significativi nella produzione e deposizione di GAGs sono stati osservati in presenza di medium M1 nelle MSCs (+106.4% per le ASCs e +40.0% per le BMSCs), e in misura minore utilizzando medium M2 (+16.6 e +11.7, rispettivamente). Nessuna induzione verso un fenotipo meniscale è stata osservata nei DFs. Conclusioni. L’utilizzo di MSCs e DFs rappresenta un grande vantaggio in applicazioni di ingegneria tissutale, in quanto fonti cellulari facilmente isolabili e dotate di un elevato potenziale proliferativo. Inoltre, le MSCs hanno mostrato un elevato potenziale fibrocondro-induttivo in presenza di TGF-β3+BMP-2, acquisendo caratteristiche del tessuto meniscale e identificandole come popolazioni cellulari adeguate in approcci di ingegneria tissutale del tessuto meniscale.