Le basi molecolari della prestazione aerobica in ipossia

Nei soggetti caucasici l’esposizione prolungata ad altitudini al di sopra dei 5000 metri induce nel muscolo scheletrico cambiamenti sia morfologici che strutturali. Negli arti inferiori si osserva una perdita del 10-15% della massa magra, una riduzione del 20-25% della densità mitocondriale ed una diminuzione dell’attività degli enzimi ossidativi nonché un significativo abbassamento della massima capacità anaerobica durante l’esercizio fisico. Lo studio proteomico consente di evidenziare variazioni nell’espressione proteica muscolare indotte dall’ascesa in quota fornendo informazioni circa le basi molecolari associate ai cambiamenti morfologico-strutturali- funzionali precedente osservati. Disegno sperimentale Lo studio proteomico è stato condotto su biopsie di muscolo vasto laterale umano ottenute da soggetti partecipanti a due spedizioni in alta quota. La prima spedizione è avvenuta sul Monte Rosa, la seconda spedizione, denominata Caudwell Extreme Everest Expedition, è avvenuta all’ Everest. Di seguito sono riportati brevemente i dettagli delle spedizioni. - Monte Rosa: esposizione progressiva a ipossia ipobarica durante il percorso di salita alla Capanna Margherita (4559). Durata del percorso: 3 giorni. Numero di soggetti indagati: 10. Biopsie muscolari: 2 per soggetto, la prima biopsia è stata effettuata a livello del mare prima dell’inizio della spedizione, mentre la seconda biopsia è stata effettuata a 4559 m tra il 7° e il 9° giorno dall’inizio della spedizione. - Everest: i soggetti partecipanti a questa spedizione si dividono in 2 gruppi: a) early Everest: esposizione progressiva a ipossia ipobarica durante il percorso di salita fino al Base Camp (5300m) del Monte Everest. Durata del percorso: 15/20 giorni. Numero di soggetti indagati: 5. Biopsie muscolari: 2 per soggetto, la prima biopsia è stata effettuata a Londra prima della spedizione e la seconda biopsia è stata effettuata in quota all’arrivo al Base Camp. b) late Everest: esposizione progressiva a ipossia ipobarica durante il percorso di salita fino alla cima del Monte Everest (8848m). Durata del percorso: 70 giorni circa. Numero di soggetti indagati: 8. Biopsie muscolari: 2 per soggetto, la prima biopsia è stata effettuata a Londra prima della spedizione e la seconda biopsia è stata effettuata in quota all’arrivo al Base Camp (5300m) nel percorso di discesa dalla cima. Metodologia Lo studio proteomico è stato condotto impiegando le tecnologie 2D-DIGE (Differential in gel electrophoresis) e ESI MS/MS (spettrometria di massa) per lo studio degli andamenti dei livelli d’espressione proteica e per l’identificazione degli spot proteici d’interesse. Le biopsie muscolari sono state lisate in un tampone di lisi, ciascun estratto proteico è stato sottoposto a marcatura fluorescente (fluorofori CyDye) e a successiva separazione mediante elettroforesi bidimensionale. Le immagini risultanti sono state acquisite mediante scanner a raggio laser (Typhoon) e processate nel software Decyder per l’analisi computerizzata. Le differenze statisticamente significative tra i livelli d’espressione proteica sono state individuate mediante applicazione del test statistico paired Student’s T-test impiegando come livello di significatività statistica p<0.05. Gli spot proteici d’interesse sono stati identificati dopo il loro prelievo automatico da gel di tipo “preparativo”, digestione con tripsina e iniezione dei peptidi eluiti nello spettrometro di massa. Risultati I principali risultati ottenuti dall' analisi proteomica dei tessuti bioptici oggetto di questi studi sono elencati di seguito: - Monte Rosa: il muscolo scheletrico di soggetti caucasici esposti per un periodo relativamente breve (7-9 giorni) all’alta quota mostra una diminuzione massiccia di proteine coinvolte nella risposta allo stress (enzimi antiossidanti, chaperone proteins) nonchè di enzimi appartenenti al ciclo degli acidi tricarbossilici, alla  ossidazione e alla fosforilazione ossidativa. Risultano interessate da deregolazione anche proteine coinvolte nell’omeostasi del ferro. La valutazione, mediante immunoblotting, della stabilizzazione di HIF1 (Hypoxia inducible factor ) e dell’aumento dell’espressione della piruvato deidrogenasi chinasi 1 ha dato risultato negativo, mentre è risultato significativamente diminuito il livello d’espressione di mTOR (mammalian target of rapamicin) coinvolto nella regolazione della sintesi proteica ( Viganò et al Proteomics, 2009). - Everest: a) early Everest: la risposta alla diminuzione di ossigeno inspirato sembra coinvolgere, nel muscolo scheletrico, l’apparato metabolico (principalmente gli enzimi della glicolisi, l’apparato di risposta allo stress e la sintesi proteica. E’ stata notata anche una modulazione a livello della mioglobina. b) late Everest: la risposta alla diminuzione di ossigeno per un periodo prolungato sembra riguardare con minor entità, rispetto alla condizione precedente, l’apparato metabolico (rimane più che altro compromesso il metabolismo aerobico), l’apparato di risposta allo stress e la sintesi proteica, mentre sembra interessare l’apparato contrattile, l'omeostasi del calcio e la risposta infiammatoria. Vi sono infatti evidenze che suggeriscono una deregolazione dell’omeostasi del Ca++ (diminuzione nella fosforilazione di isoforme di proteine contrattili, aumento del livello di espressione di una proteina coinvolta nel rilascio di Ca++ da parte del reticolo sarcoplasmatico). Si è inoltre osservata la variazione di proteine coinvolte nella glicogeno compensazione per la sintesi del glicogeno. Conclusioni Lo studio proteomico condotto su campioni prelevati da soggetti sottoposti ad altitudini e a tempi di esposizione diversi, ha permesso di tracciare un profilo degli adattamenti molecolari indotti dalla carenza di ossigeno nel tessuto muscolare.