Studi preliminari per l'introduzione di un sito di modulazione sodio-specifico nel tPA

Il tPA è sintetizzato nelle cellule dell’endotelio vascolare e secreto nel sangue come glicoproteina a catena singola costituita da 527 residui organizzati in cinque domini strutturalifunzionali. Il substrato fisiologico accertato del tPA in vivo è un singolo legame peptidico del plasminogeno (R560-V561) che viene cosi’ attivato a plasmina. La plasmina idrolizza quindi il coagulo di fibrina formato dall’azione della trombina sul fibrinogeno. Il dominio catalitico carbossiterminale del tPA (S262-P527) contiene i residui della triade catalitica delle proteine a senna della famiglia della chimotripsina (H57(322), D192(471), S195(478)) [i residui sono indicati con la numerazione delle proteine della famiglia della chimotripsina ed in parentesi è la numerazione della sequenza del tPA]. Tra essi si annoverano le proteasi alla cascata coagulativa (trombina, proteina C, fattori VII, IX, X, XI e XII), fibrinolitica (tPA, urochinasi, plasmina) e del complemento (fattori B, D, I, C2). E’ stato recentemente scoperto che l’attività di alcune tra queste proteasi è potenziata dal legame dello ione Na: nella trombina, ad esempio, in presenza di concentrazioni di Na fisiologiche si riscontra un innalzamento dell’attivita’ catalitica verso i substrati cromogenici e la maggiorparte dei substrati fisiologici fino ad un fattore 100 (1). In più del 95% delle 300 sequenze di proteasi a senna presenti in banca dati in posizione 225 si riscontra o una Tyr o una Pro. La Tyr caratterizza gli enzimi modulabili da Na, mentre la Pro quelli non modulati (1). La trombina fa parte della prima classe, mentre il tPA appartiene alla seconda (2). Il sito di legame del Na nella trombina è situato in una cavità cilindrica formata da tre segmenti 13 antiparalleli, in prossimita’ del sito di riconoscimento primario SI. Il Na è coordinato dagli ossigeni carbonilici dei residui K224 e R221a e da quattro molecole d’ acqua. L’anello fenolico del residuo Y225, distante 20 A dal sito catalitico, è ospitato in una tasca idrofobica stabilizzata da interazioni di Van der Waals con i residui V163 e V167 (3). La sostituzione dì Y225 con i rimanenti amminoacidi altera sia la specificità del Na, sia l’attività catalitica dell’enzima, tramite un meccanismo che rimane non pienamente esplicato, nonostante la risoluzione della struttura tridimensionale di 3 tra i mutanti piu’ significativi(4). La risoluzione della struttura cristallografica del dominio catalitico del tPA ne ha confermato I’ elevata omologia strutturale (>60%) con la trombina nella regione del sito di interazione con Na (5). La presenza di una Pro in posizione 225 cambia l’orientamento del carbonile di K224 facendo mancare uno dei legami di coordinazione del Na. Tuttavia la sostituzione P225Y nel tPA non introduce un legame funzionale del Na e riduce drasticamente l’attività del tPA (6). Cio’ dimostra che il residuo Tyr in posizione 225 è necessario ma non sufficiente per determinare la specificità dell’interazione con il Na e dell’effetto allosterico. Questi dipendono da una fitta rete di interazioni cui partecipano altri residui solo in parte identificati (3, 7-11). Per approfondire lo studio dei residui necessari alla costruzione di un sito Na specifico e di quelli richiesti per la comunicazione allosterica con il sito della catalisi sono state introdotte ulteriori mutazioni aminoacidiche puntiformi sia nella trombina che nel tPA. L’introduzione di un sito di modulazione da Na nel dominio catalitico ha un triplice scopo: contribuire al chiarimento del meccanismo della modulazione allosterica da Na nella trombina, enzima chiave per la regolazione della coagulazione del sangue; potenziare l’attività farmacologica del tPA, correntemente utilizzato nella terapia delI’infarto; rendere possibile i’introduzione della modulazione da Na in altre proteasi a senna del plasma, quando i meccanismi della modulazione saranno stati chiariti. 1. Dang, Q.D., & Di Cera, E. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 10653-1 0656. 2. WeIis, C.M., & Di Cera, E. (1992) Biochemistry 31, 11721-11730. 3. Di Cera, E., Guinto, E.R., Vindigni, A., Dang, Q.D., Ayala, Y.M., Wuyi, M., & Tulinsky, A. (1995) J. Biol. Chem. 270, 22089-22092. 4. Guinto, E.R., Caccia, S., Rose, T., Futterer, K., Waksman, G., & Di Cera, E. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2, 1852-1857.