Sviluppo di un metodo in hlpc-ms per la quantificazione di proteine bioattive di lupino in miscele proteiche complesse

Una delle componenti nutraceutiche più interessanti del lupino è la conglutina-gamma, una proteina matura composta da una catena pesante e una leggera collegate da legami disolfuro, dotata di un’interessante attività ipoglicemica1. Parallelamente questa proteina è considerata anche uno dei principali allergeni del lupino, anche in base ad alcune sue proprietà peculiari come la stabilità termica e la resistenza alla proteolisi che sono considerate importanti caratteristiche comuni della maggior parte degli allergeni alimentari 2. La quantificazione delle proteine biologicamente attive negli alimenti è basata principalmente su saggi immunologici che hanno tuttavia alcuni limiti tecnici, come la cross-reattività con altre proteine alimentari e risultati falsi-positivi. In alternativa si stanno affermando metodi basati sulla spettrometria di massa3. Lo scopo del nostro lavoro è stato lo sviluppo di un metodo analitico “label-free” per la quantificazione assoluta della conglutina-gamma, da utilizzare per la valutazione della qualità nutraceutica di alimenti e ingredienti alimentari. Il metodo è basato sulla separazione degli idrolizzati triptici per mezzo della HPLC-Chip, una tecnica cromatografica che consente di ottenere separazioni particolarmente efficienti. L’analisi quantitativa della proteina è stata effettuata in Multiple Reaction Monitoring (MRM), per avere una maggiore sensibilità e selettività rispetto al metodo full scan. Per la quantificazione selettiva della conglutina-gamma sono stati selezionati cinque peptidi proteotipici, cioè specifici della proteina bersaglio. La quantificazione assoluta è stata condotta mediante l’aggiunta standard di conglutina-gamma ad un grado elevato di purezza. L’effetto matrice è stato ovviato mediante l’aggiunta di quantità note di una proteina esogena (nel nostro caso albumina di siero bovino, BSA) come standard interno. L’elaborazione dei dati mediante l’uso di sistemi informatici avanzati ha permesso di ottenere rette di taratura adeguate per una quantificazione assoluta ottimale in campioni incogniti. Riferimenti: 1. Magni C, Sessa F, Accardo E, et al. J Nutr Biochem 2004;15:646-50. 2. Breiteneder, H.; Mills, E.N.C. J. Allergy Clin. Immunol. 2005, 14-22 3. Carbonaro, M. Trends in Food & Technology 2004, 15, 209-216