L’analisi in chemiluminescenza, metodologia ad elevata sensibilità, è stata da noi ampiamente utilizzata per la determinazione del rilascio di ossido d’azoto (NO) da parte di farmaci NO-donor; con questa metodologia è infatti possibile determinare la presenza di nitrati, nitriti e di nitrosotioli, forme di metabolismo e di trasporto dell’NO, nei liquidi biologici e tessuti (1-2). Sulla base di queste potenzialità, la ricerca ha avuto come oggetto la messa a punto di una metodologia per la determinazione di N-nitroso addotti (RN-NO) in preparati eparinici di natura semisintetica (nadroparine), che si formano in seguito a demolizione di eparine ad elevato peso molecolare per trattamento con acido nitroso. Il metodo si basa sulla determinazione chemiluminometrica dell’NO rilasciato dalle N-nitrosoammine (standard N-nitroso-dimetilammina, NDMA) per reazione con CH3COOH e HBr; le analisi sono state effettuate con un Chemiluminometro Nitric Oxide Analyzer Model 280 (NOA) munito di camera di campionamento per liquidi e software NOAnalysis (Sievers). Il metodo è stato convalidato in termini di specificità, linearità, limite di rilevamento (LOD), limite di quantizzazione (LOQ), precisione e accuratezza. Per quanto riguarda la specificità, le principali interferenze sono dovute agli ioni nitrito che vengono comunemente determinati per via chemiluminometrica attraverso un metodo di riduzione selettiva che utilizza la coppia CH3COOH glaciale e KI. Per poter effettuare l’analisi di N-nitrosammine anche in presenza di elevate concentrazioni di ioni nitrito, è stata utilizzata una procedura che prevede la preventiva addizione al campione di eparina (solubilizzato in acqua) di sulfanilammide (soluzione allo 0.5% in HCl 1N). La concentrazione di RN-NO è stata determinata su una serie di curve di calibrazione (n = 5) preparate solubilizzando la NDMA in acqua (intervallo di concentrazioni compreso tra 0.074 e 11.1 mg/ml; 1 - 150 µM) e iniettando aliquote da 10 microl, corrispondenti ad un intervallo, espresso in pmoli di NO iniettate, compreso tra 10 e 1500. La risposta strumentale (mV) è lineare nell’intero intervallo di calibrazione, con coefficiente di correlazione di 0.9998 ed equazione della retta y = 5.720 (± 0.00486) x – 9.561 (± 2.825), dove x = pmoli NO. Il limite di rilevamento (LOD) è risultato essere 0.074 mg/ml di NDMA, corrispondente a 740 pg iniettati e a 10 pmoli di NO iniettate, mentre il limite di quantizzazione (LOQ) è risultato essere 0.21 mg/ml di NDMA, corrispondente a 210 pg iniettati e a 28.3 pmoli di NO iniettate. La precisione e accuratezza del metodo sono state determinate per analisi replicate (n = 5) di soluzioni di NDMA a 5 livelli di concentrazione nell’intervallo di calibrazione (30, 62.5, 125, 375 e 1000 pmoli NO iniettate). I dati relativi a precisione e accuratezza intra- e inter-day indicano che il metodo è sufficientemente accurato e preciso, con valori di RE% compresi tra – 1.78% e + 12.30% della concentrazione nominale, e valori di CV% compresi tra 0.84% e 4.83% nell’ambito dell’intervallo di concentrazioni considerato. Questo ha reso possibile determinare le specie RN-NO a livelli molto inferiori, almeno di un ordine di grandezza, rispetto al limite consentito (250 ng/g) dalla Farmacopea Europea. Il metodo, applicato all’analisi di 20 campioni di nadroparine, ha indicato un’ampia variabilità nel contenuto di RN-NO in relazione al metodo di preparazione.

Sviluppo e convalida di una metodologia in chemiluminescenza per la determinazione di N-nitroso-ammine in preparati eparinici di natura semisintetica / M. Orioli, A. Piccoli, M. Merlino, M. Carini, R. Maffei Facino. ((Intervento presentato al 17. convegno Convegno Nazionale della Divisione di Chimica Farmaceutica della Società Chimica Italiana tenutosi a Pisa nel 2004.

Sviluppo e convalida di una metodologia in chemiluminescenza per la determinazione di N-nitroso-ammine in preparati eparinici di natura semisintetica

M. Orioli
Primo
;
A. Piccoli
Secondo
;
M. Carini
Penultimo
;
R. Maffei Facino
Ultimo
2004

Abstract

L’analisi in chemiluminescenza, metodologia ad elevata sensibilità, è stata da noi ampiamente utilizzata per la determinazione del rilascio di ossido d’azoto (NO) da parte di farmaci NO-donor; con questa metodologia è infatti possibile determinare la presenza di nitrati, nitriti e di nitrosotioli, forme di metabolismo e di trasporto dell’NO, nei liquidi biologici e tessuti (1-2). Sulla base di queste potenzialità, la ricerca ha avuto come oggetto la messa a punto di una metodologia per la determinazione di N-nitroso addotti (RN-NO) in preparati eparinici di natura semisintetica (nadroparine), che si formano in seguito a demolizione di eparine ad elevato peso molecolare per trattamento con acido nitroso. Il metodo si basa sulla determinazione chemiluminometrica dell’NO rilasciato dalle N-nitrosoammine (standard N-nitroso-dimetilammina, NDMA) per reazione con CH3COOH e HBr; le analisi sono state effettuate con un Chemiluminometro Nitric Oxide Analyzer Model 280 (NOA) munito di camera di campionamento per liquidi e software NOAnalysis (Sievers). Il metodo è stato convalidato in termini di specificità, linearità, limite di rilevamento (LOD), limite di quantizzazione (LOQ), precisione e accuratezza. Per quanto riguarda la specificità, le principali interferenze sono dovute agli ioni nitrito che vengono comunemente determinati per via chemiluminometrica attraverso un metodo di riduzione selettiva che utilizza la coppia CH3COOH glaciale e KI. Per poter effettuare l’analisi di N-nitrosammine anche in presenza di elevate concentrazioni di ioni nitrito, è stata utilizzata una procedura che prevede la preventiva addizione al campione di eparina (solubilizzato in acqua) di sulfanilammide (soluzione allo 0.5% in HCl 1N). La concentrazione di RN-NO è stata determinata su una serie di curve di calibrazione (n = 5) preparate solubilizzando la NDMA in acqua (intervallo di concentrazioni compreso tra 0.074 e 11.1 mg/ml; 1 - 150 µM) e iniettando aliquote da 10 microl, corrispondenti ad un intervallo, espresso in pmoli di NO iniettate, compreso tra 10 e 1500. La risposta strumentale (mV) è lineare nell’intero intervallo di calibrazione, con coefficiente di correlazione di 0.9998 ed equazione della retta y = 5.720 (± 0.00486) x – 9.561 (± 2.825), dove x = pmoli NO. Il limite di rilevamento (LOD) è risultato essere 0.074 mg/ml di NDMA, corrispondente a 740 pg iniettati e a 10 pmoli di NO iniettate, mentre il limite di quantizzazione (LOQ) è risultato essere 0.21 mg/ml di NDMA, corrispondente a 210 pg iniettati e a 28.3 pmoli di NO iniettate. La precisione e accuratezza del metodo sono state determinate per analisi replicate (n = 5) di soluzioni di NDMA a 5 livelli di concentrazione nell’intervallo di calibrazione (30, 62.5, 125, 375 e 1000 pmoli NO iniettate). I dati relativi a precisione e accuratezza intra- e inter-day indicano che il metodo è sufficientemente accurato e preciso, con valori di RE% compresi tra – 1.78% e + 12.30% della concentrazione nominale, e valori di CV% compresi tra 0.84% e 4.83% nell’ambito dell’intervallo di concentrazioni considerato. Questo ha reso possibile determinare le specie RN-NO a livelli molto inferiori, almeno di un ordine di grandezza, rispetto al limite consentito (250 ng/g) dalla Farmacopea Europea. Il metodo, applicato all’analisi di 20 campioni di nadroparine, ha indicato un’ampia variabilità nel contenuto di RN-NO in relazione al metodo di preparazione.
2004
Settore CHIM/08 - Chimica Farmaceutica
Sviluppo e convalida di una metodologia in chemiluminescenza per la determinazione di N-nitroso-ammine in preparati eparinici di natura semisintetica / M. Orioli, A. Piccoli, M. Merlino, M. Carini, R. Maffei Facino. ((Intervento presentato al 17. convegno Convegno Nazionale della Divisione di Chimica Farmaceutica della Società Chimica Italiana tenutosi a Pisa nel 2004.
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